lncRNA 调控鼻咽癌转移过程及中药干预的研究进展*

郭利培 张文青 何迎春， 田道法 王贤文

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是发生在鼻咽部黏膜的头颈部恶性肿瘤之一，发病有明显的地域倾向和种族差异，70%以上的新发病例来自东亚和东南亚地区,特别是在中国，每年新发病率占全球新病例的47.7%[1]。鼻咽癌是由遗传易感性、EB病毒（epstein-barr virus, EBV）感染和其他环境危险因素引起的疾病，发病是一个多阶段、多因素相互作用的过程，其发生发展涉及复杂的生物学机制过程，临床特征包括高侵袭性，区域淋巴结和远隔器官转移率高。包括鼻咽癌在内，90%以上的肿瘤患者并不是由于原发性肿瘤进展导致的死亡，而是由于肿瘤发生了转移[2]，一旦肿瘤转移，治疗上的难度就会大大提升，患者的生存率也会随之下降。肿瘤转移是肿瘤从原发部位脱落，侵袭到细胞外基质（extracellular matrix, ECM），进入到循环系统，穿透基底膜,漫润周边组织，扩散到体内较远位置定植形成转移瘤的变化过程，包括癌细胞上皮间质转化（EMT），细胞迁移，抵抗凋亡和血管生成几个步骤[3]。肿瘤转移是鼻咽癌治疗失败的重要原因，也是患者预后的重要因素。因此，阻止原发性肿瘤的转移是有效治愈鼻咽癌的关键所在。临床上，鼻咽癌对放射疗法敏感性较高，放射治疗是目前公认的治疗鼻咽癌有效的手段[4]，随着调强放疗在鼻咽癌中广泛应用, 鼻咽癌的局部控制率和总生存率得到了显著的提高, 但放射疗法的副作用仍然是困扰鼻咽癌患者生活质量及治疗进程的一大难题。中药治疗对鼻咽癌放化疗具有协同效果[5]，能够明显降低患者术后不良反应，由于其具有多靶点、多效应、且毒副作用低等优点，已经成为鼻咽癌综合治疗中不可或缺的一部分。随着高通量测序技术和微阵列技术的迅猛发展，最新的研究表明，长链非编码RNA（lncRNA）在癌症转移中起重要作用[6]。许多基因调节的异常改变都有lncRNA 的异常表达，而肿瘤的转移和复发也涉及了多种基因的改变，这与lncRNA 有直接相关关系。因此研究lncRNA 异常表达的分子机制和以lncRNA 为靶点的中医药治疗肿瘤的机制或许能够为早期预测肿瘤转移和利用基因靶向治疗肿瘤以及开发新药提供新的方向。

1 长链非编码RNA 的分类和功能

长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lnc-RNAs）[7]是一类转录本长度大于200个核苷酸，多数lncRNAs 由RNA 聚合酶Ⅱ转录生成，然后被剪接，多聚腺苷酸化和5＇加帽而成熟，与DNA 不同的是，lncRNA 没有完整的开放阅读框，所以不具有蛋白编码功能。大部分LncRNA 具有高度保守的近端启动子序列，外显子序列，内含子序列或二级RNA 结构，具有类型多、数量多、作用模式多的特点，主要分布于细胞核内，少量存在于细胞质中[8]。最初LncRNA 由于RNA 聚合酶保真度低，被认为是伪造的转录噪声，近年来，研究发现，LncRNA 在整个真核基因组中普遍转录，越来越多的证据表明没有蛋白质编码能力的RNA 分子在多种生物学功能中起着重要的作用，它不仅是DNA 和蛋白质之间的中介枢纽，而且还在多种层面调控基因的表达水平。根据其与邻近蛋白编码基因的关系，lncRNA 可分为5 大类[9]，如图1：①正义lncRNA：当与同一链上蛋白质编码基因的一个或多个外显子相重叠，且转录方向相同，称为正义lncRNA；②反义lncRNA：当与另一条链（反义链）上的转录物外显子相重叠时，则称为反义lncRNA；③双向lncRNA：当lncRNA 的表达起始位点与互补链上编码转录物的表达起始点十分靠近（＜1000bp）时，称为双向lncRNA；⑤内含子 lncRNA：位于蛋白质编码基因内含子区域，且与外显子没有重叠的转录本；⑤基因间lncRNA：lncRNA 位于2 个基因间的间隔中。lncRNA 的功能不仅仅局限于一套明确的功能，还可以调节多种活动，如信使RNA 降解、翻译和蛋白质动力学，或作为RNA 诱饵或支架在表观遗传学调控、转录调控及转录后调控、翻译及翻译后水平的调控、以及调控miRNA 等多个层面调控基因表达。根据其在功能上执行的原型可分为四种[10]：①信号：lncRNA可以用作分子信号，显示细胞类型特异性表达并对多种刺激作出反应；②诱饵：又被称为“分子海绵”，这种原型的lncRNA 被转录，结合并滴定蛋白质靶标，使之不发挥任何功能；③导向：向导RNA 结合蛋白质，然后将核糖核蛋白复合物的定位引导至特定靶标-顺式或者反式；④支架：lncRNA 将同时结合其多个效应伴侣，并通过这种方式将可能具有转录激活或抑制活性的效应子在时间和空间上结合在一起作为相关分子成分组装的中心平台，控制分子间相互作用和信号传递事件的特异性。肿瘤的转移和复发涉及了多种基因的改变，近年来，越来越多的研究发现，lncRNA 与肿瘤发生发展具有密切联系，lncRNA 的基因突变或者异常可以通过直接或间接的方式影响EMT、细胞外基质（extracellular matrix, ECM）降解、微血管形成等过程[11-13]，介导肿瘤细胞增殖，迁移，侵袭以及凋亡。随着人们渐渐了解到lncRNA 与肿瘤密切相关的重要性，未来对lncRNA 的深入研究将会打开预测诊断和治疗相关疾病的新世界。

图1 LncRNA 根据与邻近蛋白编码基因的关系分类

2 lncRNA 调控鼻咽癌转移过程的机制

2.1 lncRNA 调控鼻咽癌EMT 的机制

上皮间充质转化（epithelialmesenchymal transition, EMT）是指上皮细胞失去细胞极性和黏附性转化为具有迁移侵袭功能的间充质细胞的一系列过程,EMT 使肿瘤细胞从相对静止的局部增殖表型转变为更活跃和易侵袭的细胞表型，这个生物学过程对肿瘤转移非常重要[14]。在分子水平上，上皮细胞标志物如E 钙黏蛋白（E-cadherin）和β 连环蛋白（βcatenin）等的下调，间充质细胞标记物如波形蛋白（Vimentin）、N 钙黏蛋白（N-cadherin） 转录因子ZEB1、ZEB2 等的上调是观测EMT 的重要指标[15]。LncRNA 调控鼻咽癌EMT 进程主要是通过执行第二种功能原型，即作为分子海绵结合并滴定蛋白质靶标，影响相关基因的表达。凋亡相关转录本LOC284837 是一种被命名为AATBC 的lncRNA，由于最先在膀胱癌中证实调控凋亡而被关注，Tang T 等[16]研究发现lncRNA AATBC 的表达与鼻咽癌进展也密切相关，沉默该基因的表达能够有效降低鼻咽癌细胞的迁移侵袭能力，进一步研究发现AATBC是通过海绵作用作为一种ceRNA（competing endogenouse，又叫竞争性内源RNA）与miR-1237-3p 结合上调桥粒相关蛋白pinin（PNN）的表达，PNN 与上皮-间充质转化（EMT）激活因子ZEB1 相互作用，上调ZEB1 的表达以促进鼻咽癌细胞的EMT。肺腺相关转录本MALAT1[17]在多种恶性肿瘤中异常表达，研究发现，MALAT1 在鼻咽癌中可以通过与miR-124 结合作为内源性海绵，消除miR-124 诱导的对Capn4 的抑制，从而影响EMT 的进程。长链非编码RNA ZFAS1（锌指蛋白反义链1）定位于人类染色体20q13，是新发现的lncRNA，有报道其在乳腺癌中下调，但在胃癌、结直肠癌、肺癌、和胶质瘤中发生上调，Wang X 等[18]研究lncRNA ZFAS1 在鼻咽癌中的作用，发现lncRNA ZFAS1 在鼻咽癌中作为致癌基因通过PI3K/AKT 通路来促进细胞增殖和EMT 进程，抑制凋亡。RAS 相关蛋白1A（Rap1A）是RAS 癌基因家族小G 蛋白的一个成员，Rap1A 可与B-Raf相互作用，激活MAPK/ERK 通路，调节细胞内整合素的亲和力和活性，从而影响细胞粘附。LINC00460作为一种致癌基因在结直肠癌、胃癌、肺癌中高表达，研究发现[19]LINC00460 作为靶向miR30-3ps 的竞争性内源性RNA（ceRNA），调节Rap1A 的表达从而促进鼻咽癌细胞迁移、侵袭和EMT。EMT 过程需要大量的蛋白质翻译和能量，转化生长因子TGF-β1 等是一种多功能细胞因子[20]，在肿瘤细胞增殖、生成转移过程中发挥重要的调节作用，Yang J[21]研究发现TGF-β1 在鼻咽癌CNE1 细胞中可以成功诱导EMT，并通过基因测序鉴定出在此过程中多种表达异常的基因，选出一条上调最显著的转录本lnc-PNRC2-1 研究其在EMT 中的作用，发现lnc-PNRC2-1 的表达增加了其反义基因MYOM3 的表达，减少了EMT 标记的表达，但不能完全消除tgfb1 诱导的EMT，tgf-b1 诱导的EMT 可以通过抑制lnc-PNRC2-1 的表达来缓解。

2.2 lncRNA 调控鼻咽癌ECM 的机制

细胞外基质（extracellular matrix, ECM）是由蛋白质（胶原家族最丰富）、糖胺聚糖（如硫酸软骨素、硫酸肝素和透明质酸）、蛋白聚糖（如透明质酸、聚集质、异黄酮和核心蛋白聚糖）和ECM 重塑酶（如ADAM、ADAMTS 和组织蛋白酶）组成的异质结构，不同器官间的组成、比例和生化修饰都很独特[22]。异常的ECM 动态是癌症的一个标志，在肿瘤发生和转移中，ECM 调节和重塑至关重要[23]。近年来的研究表明，许多lncRNAs 在ECM 组分修饰相关的紊乱中发生异常改变，参与基因表达调控的一些层面。ECM 元件组成和配置的变化可以在表观遗传上影响细胞表型，lncRNA LINC01614 在原发性乳腺癌和乳腺癌细胞系中高表达，Vishnubalaji R 等[24]发现小分子抑制转化生长因子β（TGFβ，SB-431542）或局灶黏附激酶（FAK, PF-573228）能够通过TGF-β1和ECM 网络抵消LINC01614 的表达。另外，ECM 可以通过与整合素家族在细胞膜上形成局部粘连来指导一系列功能，肿瘤上皮细胞经常大量分泌laminin-332（LAMA3、LAMB3 和LAMC2 编码），不断表达整合素α6β4 （ITGA6 和ITGB4 编码）。laminin-332 是一种重要的ECM 分子，也是整合素α6β4 的主要配体[25]。连接后，整合素通路通过局灶粘附激酶（focal adhesion kinase, FAK）的磷酸化被激活，诱导下游信号通路。lncRNA CASC9 在许多癌症中被证明是失调，Liang 等[26]研究发现，CASC9 在食管鳞癌组织中表达显著上调，CASC9 与ECM-整合素相互作用影响相关的基因表达，证明整合素上游诱导剂LAMC2 上调能够促进食管鳞癌转移，CASC9 通过与核内转录共激活因子creb 结合蛋白（CBP）结合相互作用上调LAMC2 的表达，使整合素通路下游效应子（FAK、PI3K 和Akt）磷酸化，随后激活FAK-PI3K/Akt 信号通路促进转移。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）能够降解ECM中的各种蛋白成分，破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤细胞浸润转移中的作用日益受到重视，lncRNA ENST00000412010 位于9 号染色体上，在鼻咽癌中异常表达，Cheng 等[27]沉默鼻咽癌中的lncRNA-ENST00000412010，基质金属蛋白酶-7（MMP-7） 和周期蛋白依赖性激酶4 抑制剂B（CDKN2B）的mRNA 表达显著下调，鼻咽癌细胞存活能力下降，证明lncRNA ENST000 00412010可能通过调节细胞增殖和ECM 在鼻咽癌的发生过程中发挥作用。HOX 反义基因间RNA（HOTAIR）编码自染色体12q13.1315 上的HOXC 基因座，HOTAIR 具有2158 个核苷酸，通过修饰染色质结构在基因调控中发挥重要作用[28]，在结直肠癌、宫颈癌、膀胱癌、肝癌等多种肿瘤的发生和转移中都有参与[29]。肪酸合酶（fatty acid synthase, FASN）是一种多功能酶，以NADPH 依赖的方式催化棕榈酸酯的合成，在肿瘤细胞中，脂类的功能需求增加，如膜生物合成、蛋白质修饰和信号分子，所以肿瘤细胞比正常细胞更加依赖FANS 催化的棕榈酸酯合成，Ma 等[30]发现FASN 的表达与HOTAIR 呈正相关，并且下调HOTAIR 可以通过降低MMP-9 和p21 蛋白的表达水平导致鼻咽癌细胞FASN 的下调，从而抑制细胞增殖和侵袭，影响鼻咽癌ECM。

2.3 lncRNA 调控鼻咽癌血管形成的机制

肿瘤发生转移侵袭与微血管的生成密切相关[31]，随着原位肿瘤细胞的不断增殖, 肿瘤组织开始建立起自己的血管网, 因为新生的血管内皮和基底膜有缺陷,肿瘤细胞易穿越基底膜屏障进入血液循环,进入循环系统后,它们通过形成同聚物或与白细胞、血小板形成异聚合物, 留驻在远端血流缓慢的毛细血管网处,进而粘附微血管内皮并诱导内皮绷解，完成远端扩散和转移[32]。VEGF 是促进肿瘤血管新生和生长的重要因子[33]，它能够促进血管形成，增加血管的通透性，介导细胞的迁移和浸润。剪接因子丝氨酸/精氨酸重复基质蛋白2-选择性剪接（lncRNA SRRM2 AS）肌凝蛋白轻链激酶（MYLK）主要功能是磷酸化肌球蛋白轻链Thr18 和Ser19，环磷酸鸟苷（cGMP）依赖和cGMP 独立的途径可以诱导MYLKA的激活，cGMP 为第二信使分子，可通过蛋白激酶G（PKG），PKG 是cGMP 信号转导的重要下游调控因子，Chen 等[34]研究发现lncRNA SRRM2 AS 可以通过调节MYLK-介导的cGMP PKG 信号通路来参与NPC 增殖、分化和血管生成。Forkhead box C1（FOXC1）是Fox 转录因子家族的成员，在多种恶性肿瘤中过表达[35-37]，参与肿瘤生物学过程。Xu 等[38]发现lncRNA FOXCUT 可以调控FOXC1 mRNA 水平，FOXCUT 沉默后MMP7、MMP9、VEGF-A 和βcatenin 的表达均降低，鼻咽癌细胞增殖迁移水平显著下降，推测FOXCUT 通过靶向FOXC1 参与调控鼻咽癌EMT 进展和肿瘤血管生成过程。LncRNA HOTAIR 最初在乳腺癌中发现[39]，HOTAIR 基因介导了多种肿瘤发生和转移，萄糖调节蛋白78（GRP78）又称免疫球蛋白重链结合蛋白（BiP），属于热休克蛋白70（HSP70）家族，GRP78 与各种肿瘤类型的进展高度相关[40，41]。Fu 等[42]研究HOTAIR 基因敲除直接抑制VEGFA 转录激活，并通过下调GRP78 的表达降低VEGFA 和Ang2 的表达。确定了HOTAIR 是通过直接促进VEGFA 转录以及通过上调GRP78 表达激活VEGFA 和Ang2 表达来介导肿瘤发生和血管生成的。抗肿瘤的血管形成已成为现代肿瘤治疗学研究的热点，目前为止，与lncRNA 介导血管生成机制影响鼻咽癌进展过程的研究还为数不多，了解lncRNA 与血管生成具体的分子机制有助于靶向抗鼻咽癌药物的研发，随着临床研究的进步，相信lncRNA 的演技在抗血管生成中发挥重要的科研价值。

3 以lncRNA 为靶点中药防治鼻咽癌

中药是来源于自然界中的天然药物, 具有毒副作用低，有效成分复杂，治疗作用广泛等特点，随着中药药理研究的不断不深入，中医药逐渐被大家认可接受。研究表明，中药可以通过调控肿瘤相关LncRNA 直接或间接地发挥抗肿瘤作用[43]，人源基因LncRNA TUC.338 由克隆多聚胞咤啶结合蛋白2基因独立转录后形成的转录片段克隆而来，位于12号染色体上，Yu 等[44]研究发现LncRNA TUC.338 在胃癌组织中表达水平高于癌旁，通过实验证明敲低LncRNA TUC.338 能够抑制胃癌细胞增殖转移，同时利用半夏泻心汤干预后发现半夏泻心汤能够抑制该基因的表达，于是推测半夏泻心汤的作用机制可能是与它下调胃癌细胞中Lnc RNA TUC.338 的表达相关。益气除痰方是广州中医药大学第一附属医院治疗非小细胞肺癌的经验方，临床上能够明显改善患者生活质量，Jiang 等[45]研究发现益气除痰方抑制肺癌细胞侵袭转移的机制可能是通过下调MALAT-1，抑制Smad2/3 磷酸化,从而抑制肺癌细胞发生上皮间质转化的进程。姜黄素是在中药姜黄、莪术中提取的有效单体成分，它能调节多种信号分子参与药理作用，lncRNA AK294004 是通过基因芯片筛选出的在鼻咽癌中显著上调的差异表达基因，Fan 等[46]通过研究证实姜黄素调控能够调控lncRNA AK294004 靶向逆转细胞周期蛋白CCND1 实现放射增敏。黄芩素是中药黄芩中的主要成分，Yu 等[47]研究发现在鼻咽癌中黄芩素可通过调控MAPK 及p53 信号通路抑制鼻咽癌细胞增殖并诱导其凋亡，此外，还可通过下调MMP1、MMP2、MMP7 及MMP 9mRNA 的表达抑制鼻咽癌细胞侵袭和迁移，但其具体调控机制尚未阐明。目前，以lncRNA 为靶点的中药治疗鼻咽癌的研究目前尚还处于初步阶段，但随着研究者们对中药及lncRNA 的关注，相信在将来一定能够探索出其具体分子机制。

4 前景与展望

鼻咽癌对放疗的敏感度较高，目前，调强放疗在鼻咽癌的治疗上已经广泛应用，鼻咽癌的治疗取得了一大进步，虽然鼻咽癌的治疗已经有了进展，但面对鼻咽癌转移和复发仍然是个棘手的问题。中药作为一-种天然药物，具有多靶点、多效应、副作用低等特点，在临床上能够明显降低患者术后不良反应，并且中药可以在多层次、多方面领域发挥药理作用。随着微阵列技术和高通量测序应用的迅猛发展，越来越多的研究证明LncRNA 在多种肿瘤发生发展过程中发挥重要作用，这让科研人员们看到了治疗肿瘤转移和复发的新希望。但lncRNA 分子结构复杂，在肿瘤转移中的具体分子机制还有待探索，以lncRNA 为靶点中药抗鼻咽癌的研究更是刚刚起步。本篇综述概括了lncRNA 在EMT 过程、细胞外基质降解、血管生成部分中如何调控基因的表达来参与鼻咽癌细胞生长和转移，以及以lncRNA为靶点中药抗鼻咽癌的研究，展望利用基因靶向治疗恶性肿瘤是一种很有前景治疗策略，但其具体的开发靶向药物针对性治疗肿瘤还将是一个漫长的过程。