桃慢溶质性状的遗传倾向及初步定位

孟君仁 牛良 潘磊 崔国朝 孙世航 段文宜 曾文芳 王志强

摘要：【目的】多数桃品种果实在成熟后迅速软化，导致来不及采收、采后易腐烂，是制约桃产业发展的关键问题。慢 溶质桃具有较长的硬熟期，可以减轻因果实软化造成的损耗，是未来桃耐贮运育种的重要方向之一。【方法】以慢溶质 品种春雪、春瑞为试材，通过构建群体、肉质评价，对慢溶质性状进行遗传分析和集群分离分析（bulk segregant analysis， BSA）定位。【结果】通过对比慢溶质品种和非慢溶质品种成熟过程中软化的特点，发现慢溶质留树时间较长，乙烯 延迟释放。在慢溶质分离群体中，留树时间呈明显的双峰分布，遗传倾向分析表明慢溶质受到单基因或主效数量性状 基因座（quantitative trait locus，QTL）控制，春雪慢溶质位点为杂合，春瑞为纯合。以春雪桃自交群体为试验材料，基于 BSA分析，将慢溶质定位到桃第4 号染色体4 个区段，总长度7.87 Mb。【结论】桃慢溶质性状遗传受显性单基因或主效 基因控制，其控制基因位于第4号染色体。

关键词：桃；果实；慢溶质；软化

中图分类号：S662.1 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2023）06-1064-08

桃（Prunus persica）原產中国，自1993 年起中国 桃的栽培面积和产量全面超过意大利和美国，成为 世界第一产桃大国，并一直保持至今[1]。桃因皮薄 肉厚、味道鲜美而广受消费者喜爱[2]。与柑橘、苹 果、梨等水果不同，大多数桃果实成熟后迅速软化， 留树时间和货架期短，若提前采收又会导致果实品 质下降，影响消费体验。此外，随着桃产业向集约化 方向的发展，采后远距离运输成为常态，软溶质桃不耐贮运的短板很大程度上限制了该种肉质类型桃的 发展。

质地影响桃果实留树期和贮运性。目前桃果肉 质地性状主要包括：溶质（melting flesh，MF）、不溶 质（non- melting flesh，NMF）、硬质（stony hard） 等[3]。不溶质桃成熟后果实有韧性，留树时间较长， 传统上多用于加工罐头，当前也有部分品种进入鲜 食市场。硬质桃果实成熟后不释放乙烯，果实保持 硬脆，留树时间2 周以上，具备优异的采后贮运特 性[4]，但该种类型果实成熟后不变软，伴随着没有果 实成熟期桃特征性香气，因此也有一些局限性。此 外，国外最早于2011 年报道了油桃品种Big Top 独 特的软化特征，这种肉质虽然最终会释放乙烯使果 实变软，但果实在成熟前期能保持较高的硬度，具有 较长的留树期和货架期[5-6]，并将这一质地类型分类 为慢溶质桃（slow-melting flesh，SMF）。Chen 等[7]对 慢溶质单株S11-8 与非慢溶质单株M12-10 成熟过 程硬度变化规律进行比较，发现S11-8 软化速度比 M12-10 慢得多，而且S11-8 完全软化的发生相对较 晚。Ghiani 等[6]通过比较慢溶质型桃Big Top 和溶质 型桃Bolero 采收后硬度和乙烯的变化，发现果实成 熟期的Big Top 果实硬度比Bolero 明显更硬，采后室 温放置5 d 后果实变软，最终果实硬度与Bolero 类 似。在果实成熟期采收后，Bolero 桃迅速释放乙烯， 而Big Top 桃果实采收后4 d 才开始释放乙烯。对于 慢溶质性状定位的研究也有一些报道，但由于肉质 判别标准的缺乏导致基因定位困难，已发表的定位 结果表现出较大的差异，相关分子标记仍未能实践 应用[7-9]。

慢溶质桃成熟后既有较长的留树时间和货架 期，又能够保持桃果实的特殊风味，已成为欧美国家 桃肉质改良和发展的主要方向，但是，慢溶质桃在中 国相对较晚才被利用，遗传资源匮乏，相关机制研究 甚少。笔者在本研究中以春雪、春瑞等慢溶质桃品 种为材料，通过构建分离群体，对后代表型进行分 析，明确慢溶质性状的遗传倾向，利用BSA 分析对 该性状进行初步定位。研究结果初步揭示了桃果实 慢溶质肉质类型的生理特征、遗传倾向及初步定位， 为今后慢溶质候选基因的挖掘以及调控机制的研究 奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以SMF品种春雪、春瑞为主要亲本构建遗传群 体，具体信息见表1。对杂交单株的肉质鉴定于 2021 年5—8 月和2022 年5—8 月在中国农业科学院 郑州果树研究所新乡试验基地的杂种苗定植圃内进 行，株行距为1.0 m×4.0 m，2017 年定植。慢溶质桃软化特点分析所用品种为春丽、春瑞，非慢溶质分析 所用品种为春美、春蜜，均来自中国农业科学院郑州 果树研究所桃育种圃。

1.2 试验方法

1.2.1 自交选择生长健壮的成年树作母本树，于 蕾期对全株进行套袋，防止异花授粉，2 周后去除纸 袋。其他管理按常规。

1.2.2 杂交选择生长健壮的成年树作母本，于大 蕾期去雄，点授父本花粉，套袋，10 d 后去袋，其他管 理按常规。

1.2.3 果实生理指标测定果实成熟阶段的样品， 果实达到八成熟开始采集，每3 d 取样1 次，每次20 个果实。采样时间点设为R、R+3、R+6、R+9、R+12、 R+15，代表八成熟后天数。果实采收后，立即带回 实验室，选取大小均匀、成熟度一致、无病虫害和机 械损伤的果实，用于软化生理特点分析。随机选取9 个果实，在果实赤道处，削去缝合线两侧及对面部 位的果皮，用水果硬度计GY-4 测定果实去皮硬度， 每个果实的三个部位的平均值作为每个果实的果肉 硬度，单位为牛顿（N）。乙烯测定参考Zeng 等[10]的 方法：随机选取9 个果实，3 个为一组，置于密封的 2.0 L保鲜罐中，密闭2 h，取1 mL气体，用气相色谱 仪GC-2010（岛津，日本）测定乙烯释放量，单位为 nL · g- 1 · h- 1。气相色谱仪条件为：AI2O3/S 色谱柱 （30 m×0.53 mm，0.25 μm）；柱温50 ℃，SPL1 检测室 温度为200 ℃，FID1 检测室温度为200 ℃；载气氮 气流速为32 mL·min-1，氢气流速为40 mL·min-1，空 气流速为400 mL·min-1。

1.2.4 杂交群体后代果实性状调查通过判断果实 着色完全、果个已膨大到商品果大小、果皮底色已完 成褪绿、品质风味已可食用，即果实成熟，之后每2 d 调查1 次果实硬度，参考王力荣等[11]的方法将硬度 划分为“很硬、硬、中、软、很软”5 个等级，统计杂种 单株70%果实在成熟后变软之前的挂树时间，大于 等于10 d为慢溶质，小于10 d 为非慢溶质。

1.2.5 BSA 分析在群体后代中分别选取非慢溶 质（留树时间＜6 d）或慢溶质（留树时间＞14 d）各 20 株，组成2 个极端性状混池（非慢溶质混池为NSMF pool，慢溶质混池为SMF pool），提取基因组 DNA，委托北京百迈客生物科技有限公司进行重测 序，全部样品的测序深度为30 倍。参考基因组为桃 Lovell（https：//www.rosaceae.org/gb/gbrowse/prunus_ persica_v2.0.a1/）。利用两混池间基因型存在差异 的SNP、InDel 位点[12]，统计差异位点在不同混池中 的深度，并计算每个位点ED（欧氏距离，Euclidean Distance）值。为消除背景噪音，对原始ED 值进行 乘方处理，笔者在本试验中取原始ED的5 次方作为 关联值以达到消除背景噪音的功能，然后采用DISTANCE 方法[13]对ED值进行拟合。取所有位点拟合 值的median+3SD 作为分析的关联阈值，计算得 0.10，设定为筛选的阈值，阈值外的区域为潜在候选 调控基因定位区域。

1.2.6 数据统计分析与作图数据统计分析与作图 采用微软Excel 2019。

2 结果与分析

2.1 慢溶质品种成熟过程中硬度变化与乙烯释放

为了显示慢溶质桃成熟过程中的软化特征，选 择成熟期相近的两组慢溶质桃vs 非慢溶质桃—春 丽vs 春美（图1）和春瑞vs春蜜（图2）进行比较。结果 显示，非慢溶质品种春美、春蜜果实硬度在成熟后9 d 已降至最低，慢溶质品种春丽、春瑞果实在成熟后15 d 才完全软化。非慢溶质桃春美和春蜜成熟阶段硬度 保持在15 N以上的时间仅6 d；慢溶质桃春丽和春瑞 至少12 d。因此，将果实成熟后硬度保持在15 N以 上水平的时期定为果实留树时间，慢溶质桃留树时间 （天数）是非慢溶质桃的2 倍左右。慢溶质桃品种春 麗在R+12 阶段之前乙烯释放量很低，春瑞在R+12 阶段之前没有乙烯释放，慢溶质桃直到最终软化发生 时才伴随乙烯大量释放；而非慢溶质桃品种在R+6阶 段开始就产生很高的乙烯释放量。综上两组数据，慢 溶质桃春瑞、春丽留树时间至少12 d，相较非慢溶质桃春美、春蜜长6 d，乙烯也相应延迟释放。

2.2 慢溶质群体后代肉质鉴定及遗传倾向

为了更高效快速鉴定群体后代表型，笔者对不 同组合后代果实留树时间进行评价，判别果实肉 质。对春雪自交群体进行表型评价，发现后代留树 时间呈双峰分布，集中在＜5 d 和≥10 d，中间类型 6～9 d几乎没有（图3-A），慢溶质桃∶非慢溶质桃=67∶ 21。对春雪×99-30-33 群体进行表型评价，发现后代 留树时间呈双峰分布，集中在＜5 d 和≥10 d，中间类 型6～9 d 只有5 个单株（图3-B），慢溶质桃∶非慢溶质 桃=28∶33。对04-1-91×春瑞和04-3-25×春瑞进行表 型评价，后代留树时间只有≥10 d 一种类型，后代没 有出现＜10 d 的类型，群体后代全部为慢溶质桃类 型（图3-C～D）。

春雪组合后代群体中肉质分离，春瑞组合后代 中肉质不发生分离。因此，推测亲本慢溶质桃基因型春雪为杂合，春瑞为纯合。春雪自交群体慢溶质 桃∶非慢溶质桃分离数据经卡方检验符合3∶1 孟德 尔理论分离比例，春雪×99-30-33 群体慢溶质桃∶非 慢溶质桃分离数据符合1∶1 的分离比例（表2），说 明慢溶质桃性状的分离比例与显性单基因或主效 基因调控性状的分离比例一致。

2.3 慢溶质性状初步定位

以春雪为亲本自交构建的遗传分离群体为试 材，根据分离单株肉质表型的鉴定结果，选取极端非 慢溶质单株和极端慢溶质单株各20 株，构建非慢溶 质、慢溶质基因池，进行BSA定位分析。为了鉴定慢 溶质桃调控位点，对两个混池进行高通量特异性片段测序，非慢溶质池和慢溶质池的测序深度分别为 33 倍和37 倍。在混池之间共获得79 304 个SNP 和 21 715 个InDel，采用欧氏距离法（Euclidean Distance， ED算法）定位分析方法，将该性状的调控位点 关联到了第4号染色体（图4）。关联分析共得到4个 与慢溶质桃性状相关的候选区域，总长度为7.87 Mb （表3）。

3 讨论

桃是典型的呼吸跃变型果实，在成熟后期出现 很高的呼吸高峰，果实迅速软化[14]。笔者对慢溶质 桃品种春丽、春瑞成熟软化的生理特点进行分析，留 树时间长达12 d 以上，在成熟前期保持较高的硬度， 这与前人[7]对慢溶质桃杂交单株S11-8 的生理特征观察结果一致。慢溶质桃与MF相比，前者果实乙 烯释放延迟发生，果实软化相应延迟，这可能是慢溶 质桃硬熟期长的原因。除此之外，对慢溶质桃遗传 倾向的分析也与前期春雪×春美杂交后代的研究结 果一致[15]。此外，Chen等[7]通过对春雪和红不软的F1 群体分析，发现后代慢溶质桃∶非慢溶质桃接近1∶1， 推测春雪慢溶质桃位点也为杂合，可能受显性单基 因控制。

慢溶质性状的基因定位研究相对匮乏，并且没 有获得准确的定位区间。Serra 等[8]以慢溶质型桃品 种Big Top 为父本，两种溶质型（Armking 和Nectaross） 分别为母本，构建杂交群体，通过高密度SNP芯 片构建遗传图谱，定位了与慢溶质桃性状相关联的 3 个区段，分别位于第4、5、6 三条染色体上。Ciacciulli 等[9]通过建立力学模型，对慢溶质型BRebus028 和MF型BMax10 杂交后代进行表型评价，进行连锁 作图，将慢溶质桃定位到第8 号染色体上的一个 QTL（qSwS8.1），并利用全基因组关联分析（genomewide association study，GWAS）进行了验证。Chen 等[7]通过BSA-seq 鉴定到了第4 号染色体两个QTL， 并结合转录组分析，在5.6 Mb定位区间内鉴定到了 29 个可能的慢溶质基因。笔者在本试验中通过对 春雪自交后代的连续调查，结合遗传定位分析将慢 溶质桃定位在了桃第4 号染色体上，与Serra 等[8]和 Chen 等[7]的定位结果一致，且有一定的重叠，未来需 要进一步研究缩小慢溶质桃定位区间，挖掘慢溶质 桃性状的候选基因。

此外，桃果實成熟期也可能对肉质有影响，在对 春雪分离群体的调查发现，亲本春雪含有极早熟的 基因，5 月底之前成熟的极早熟单株中没有发现慢 溶质桃，之后全部为慢溶质桃。由于控制成熟期的 遗传位点被定位在第4 号染色体[15-17]，与慢溶质桃在 同一连锁群上，后代极早熟单株中没有慢溶质型，可 能是慢溶质桃与熟期性状存在不完全连锁。笔者在 本试验中进行BSA 定位的两个混池之间除了肉质 的显著差别外，也无法规避熟期的差异，熟期会影响 对肉质的判定。因此，定位结果中包括了与熟期相 关的基因，这也为慢溶质候选基因的筛选增加了一 定难度。后续笔者将利用基因组重测序数据，在定 位区间开发更多标记，通过更多群体进行验证，更精 细地对慢溶质性状进行定位，为慢溶质分子标记辅 助育种提供帮助。

4 结论

通过对慢溶质和非慢溶质桃成熟软化的生理差 异进行比较，发现慢溶质桃春丽、春瑞成熟期留树时 间长达12 d，是非慢溶质桃春美、春蜜的2 倍左右， 乙烯延迟释放，果实最终变软。遗传倾向分析表明， 慢溶质性状为显性单基因或主效基因控制遗传，且 调控基因定位在第4号染色体上。

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