番泻叶苷A基于AMPK/Nox4信号通路对糖尿病肾病小鼠的作用

申 亮,王培珍,王 鑫

1.华北医疗健康集团峰峰总医院中医科,邯郸 056200;2.河北省沧州中西医结合医院中药药学部,沧州 061000;3.衡水市中医院内分泌肾病科,衡水 053000

糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是由糖尿病引发的慢性微血管并发症中危害性最大的一种疾病[1]。DN对于肾组织造成的损伤是不可逆的,主要病理表现为细胞外基质(extracellular matrix, ECM)增生,最终发展为肾小球硬化和肾小管间质纤维化[2]。番泻叶苷A(sennoside A, SA)是大黄、番泻叶等中草药的主要活性成分,有报道称SA可改善DN大鼠肾损伤和炎性反应[3-4]。本研究则以高脂喂养联合链脲佐菌素(streptozocin, STZ)注射方法建立DN小鼠模型,进一步探讨SA对DN小鼠肾组织的保护作用及机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

RM2235徕卡切片机(德国徕卡显微系统贸易公司);DxC700AU全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司);HA-8180全自动糖化血红蛋白分析仪(日本爱科莱公司);AccuCheck血糖仪(德国罗氏公司);CheniDoc XRS化学发光成像分析系统、PowerPac电泳仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 试药

番泻叶苷A(质量分数>98%,上海源叶生物科技有限公司);链脲佐菌素(质量分数>99%,北京诺其雅盛生物科技有限公司);转化生长因子(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、尿素氮(blood urea nitrogen, BUN)和尿总蛋白(urine total protein, UTP)试剂盒均购自美国R&D公司;血清肌酐(serum creatinine, Scr)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assy,ELISA)试剂盒(英国Cayman公司);超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)ELISA试剂盒均购自美国DSL公司;腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抗体、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(phosphorylated AMP-activated protein kinase,p-AMPK)抗体均购自美国CST公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(nicotinamide adenine dinucleotide phosphatase oxidase 4, Nox4)抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin,Ig G)均购自美国Abcam公司。

1.3 动物

80只SPF级雄性C57BL/6小鼠,10周龄,体质量为(24±2) g,购自赛业模式生物研究中心(太仓)有限公司,许可证号为SCXK(苏)2018-0003,12 h/12 h明暗交替,室温饲养。

2 方法

2.1 建模

取64只小鼠用STZ腹腔注射法建立DN模型。小鼠用高脂高糖饲料喂养6周后,制备10 g·L-1STZ溶液(溶于pH值为4.4的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中),按40 mg·kg-1·d-1的剂量注射,对照组注射柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液,连续7 d[5]。72 h后测空腹血糖,收集24 h尿液,测24 h UTP,血糖≥16.7 mmol·L-1、24 h UTP≥30 mg表明DN小鼠模型建立成功[6]。

2.2 干预方法

将建模成功的小鼠随机分为模型组及SA低、中和高剂量组4组,各16只。SA低、中和高剂量组分别以15、30、60 mg·kg-1剂量按3 mL·d-1腹腔注射SA[7],连续给药28 d。对照组和模型组注射等体积生理盐水。

2.3 一般指标观察

各组小鼠干预后禁食12 h后称取体质量,并通过尾静脉采血,检测各组小鼠血糖(fasting blood glucose, FBG)变化;收集各组小鼠干预结束24 h后尿液;用30 mg·kg-1戊巴比妥钠麻醉小鼠,腹主动脉采集血液样本后以3 000 r·min-1离心15 min,取上清,-80 ℃保存;断颈处死小鼠后取双侧肾脏,去除脂肪组织,4 ℃预冷生理盐水冲洗,滤纸吸取水分后用电子天平称定质量,计算肾指数。肾指数=双肾质量(mg)/处死前总体质量(g)。

2.4 肾功能、糖脂代谢指标检测

取各组小鼠2.3血清样本,全自动生化分析仪检测血清高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、三酰甘油(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和胆固醇(cholesterin, TC)水平;ELISA检测血清Scr、BUN水平;用糖化血红蛋白分析仪检测糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin A1c, HbA1c)水平。取各组小鼠2.3尿液样本用试剂盒检测24 h UTP水平。

2.5 组织学观察

取各组8只小鼠肾组织于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h,经梯度体积分数的乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋、切片,常规HE染色,封片后于显微镜下观察。

2.6 肾组织TGF-β1、TNF-α水平检测

取各组剩余小鼠肾组织,将肾组织剪碎,加入预冷PBS缓冲液(固液比=1∶9)于冰上匀浆,匀浆液于4 ℃以8 000 r·min-1离心10 min,取上清低温保存。取部分肾组织匀浆上清按照ELISA试剂盒说明书操作,用酶标仪测定450 nm处样品的吸光度(A)值,根据样品A值计算TGF-β1、TNF-α质量浓度。

2.7 肾组织SOD、MDA和CAT水平检测

取肾组织匀浆上清,严格按照ELISA试剂盒检测,用酶标仪于450 nm处测定SOD的A值,在535 nm处测定MDA的A值,根据A值计算样品SOD和MDA的水平。

2.8 肾组织中相关蛋白表达水平检测

取肾组织匀浆上清用BCA试剂盒进行蛋白定量,取样本20 μg与等量上样缓冲液混匀进行SDS-PAGE电泳,100 V电转30 min,转至PVDF膜上,适量封闭液室温封闭2 h,将膜放入1∶1 000稀释的AMPK、p-AMPK和Nox4一抗中,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜,再放入1∶4 000稀释的二抗中,室温孵育1 h,TBST洗膜。向PVDF膜滴加适量显影液,置于凝胶成像仪的显影区,设置参数后于暗室中曝光、显影,Image J软件分析。蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参β-actin蛋白条带灰度值。

2.9 统计学方法

3 结果

3.1 肾脏指数和肾功能指标的比较

模型组肾脏指数、BUN、Scr和24 h TUP水平较对照组升高,SA各剂量组肾脏指数、BUN、Scr和24 h TUP水平较模型组降低(P<0.05);肾脏指数、BUN、Scr和24 h TUP水平与SA呈剂量依赖性降低(P<0.05)。见表1。

表1 肾脏指数和肾功能指标的比较

3.2 各组小鼠糖脂代谢指标比较

模型组给药后TC、TG、LDL-C、FBG和Hb Alc水平较对照组升高,HDL-C较对照组降低(P<0.05);SA各剂量组TC、TG、LDL-C、FBG和Hb Alc水平较模型组降低,HDL-C较模型组升高(P<0.05);TC、TG、LDL-C、FBG和Hb Alc水平与SA呈剂量依赖性降低,HDL-C与SA呈剂量依赖性升高(P<0.05)。见表2、表3。

表2 各组小鼠脂代谢指标的比较

表3 各组小鼠糖代谢指标的比较

3.3 肾组织病理学比较

对照组肾组织结构正常,未见明显病理学变化;模型组肾小球增生肥大存在肿胀变形、组织结构排列不均匀,肾小管上皮细胞可见大量炎性细胞浸润,腔间隙缩小,SA低剂量、中剂量和高剂量组小鼠肾组织的不良形态有所改善,SA低剂量、中剂量和高剂量组小鼠肾小球变形减轻,上皮细胞炎性细胞浸润明显减少。见图1。

3.4 各组小鼠TGF-β1、TNF-α水平比较

模型组TGF-β1、TNF-α水平较对照组升高(P<0.05);SA各剂量组TGF-β1、TNF-α水平较模型组降低(P<0.05);TGF-β1、TNF-α水平与SA呈剂量依赖性降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠TGF-β1、TNF-α水平的比较

3.5 各组小鼠SOD、MDA水平的比较

模型组MDA水平较对照组升高,SOD水平较对照组降低(P<0.05);SA各剂量组MDA水平较模型组降低,SOD水平较模型组升高(P<0.05);MDA水平与SA呈剂量依赖性降低,SOD水平与SA呈剂量依赖性升高(P<0.05)。见表5。

表5 各组小鼠SOD、MDA水平的比较

3.6 肾组织中p-AMPK、Nox4蛋白的表达水平比较

模型组Nox4蛋白的表达水平较对照组升高,p-AMPK蛋白的表达水平较对照组降低(P<0.05);SA各剂量组Nox4蛋白的表达水平较模型组降低,p-AMPK蛋白的表达水平较模型组升高(P<0.05);Nox4蛋白的表达水平与SA呈剂量依赖性降低,p-AMPK蛋白的表达水平与SA呈剂量依赖性升高(P<0.05)。见表6、图2。

注:A.对照组;B.模型组;C.SA低剂量组;D.SA中剂量组;E.SA高剂量组。

表6 肾组织中p-AMPK、Nox4蛋白表达水平的比较

4 讨论

DN初期病症为肾小球滤过能力增高及尿白蛋白外排,故UTP和BUN可作为其诊断标准[8]。Scr是肌肉代谢产物,一般随尿液排出,而当肾组织出现功能障碍时,Scr排出被抑制。DN的发生、发展与血糖、血脂水平紊乱有关。高糖导致各种细胞因子活化、激活,促进肾脏系膜区细胞外基质(extracellular matrix,ECM)合成,高脂使脂肪存储于肾脏增加了由LDL介导的氧化应激和肾小球巨噬细胞释放化学介质[9-10]。TGF-β1是糖尿病中导致肾脏ECM积累的关键细胞因子,可促进炎症因子TNF-α的分泌,导致ECM堆积从而加速DN进展[11-12]。而肾脏氧化应激是TGF-β1高表达和ECM增生的主要原因之一[13]。MDA的含量变化反映了过氧化程度[14],SOD是MDA主要的清除酶,反映机体的抗氧化损伤能力[15]。本研究中SA各剂量组肾脏指数、BUN、Scr、24 h TUP、TC、TG、LDL-C、FBG、HbAlc、TGF-β1、TNF-α和MDA水平较模型组降低,HDL-C、SOD水平较模型组升高,表明SA可有效促进DN小鼠肾功能的恢复,改善糖脂代谢,降低炎症反应和氧化应激损伤,延缓肾脏纤维化从而保护肾脏。

AMPK不仅是细胞负责调节机体的糖脂代谢和能量代谢的能量传感器,还是调控细胞氧化平衡的传感器[16]。作为AMPK调控氧化平衡的下游,Nox4在肾小球和肾小管细胞中广泛表达,介导Nox4可引发肾组织释放大量活性氧,促进肾纤维化损伤[17-18]。有研究报道,AMPK的激活可以阻断Nox4活性,减少活性氧积累,抑制糖尿病肾脏肥大和ECM表达增加[19]。通过激活AMPK/Nox4信号通路,可保护单侧输尿管梗阻诱导的小鼠肾损伤[20]。本研究中SA各剂量组Nox4蛋白表达水平较模型组降低,p-AMPK蛋白表达水平较模型组升高,表明SA可改善DN小鼠的糖脂代谢紊乱,减少氧化应激损伤,可能与AMPK/Nox4信号通路蛋白调控有关。

综上所述,SA可有效恢复DN小鼠肾功能,改善糖脂代谢紊乱,降低炎症反应和氧化应激损伤,其可能与调控AMPK/Nox4信号通路有关。