黄腐酚抑制膝骨关节炎大鼠软骨组织细胞自噬作用

胡 杰,杜岩松,王万宏

1.唐山市工人医院风湿免疫科,唐山 063000;2.石家庄栾城人民医院骨科,石家庄 051430;3.唐山市丰南区医院神经外科,唐山 063300

膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)是一种临床常见的关节风湿性疾病,以膝关节疼痛、肿胀、关节僵硬、丧失活动能力和关节软骨细胞病变坏死为主要病理特点[1]。软骨细胞作为关节软骨的唯一细胞,仅靠关节液中的营养合成细胞外基质维持关节软骨的健康平衡,软骨细胞的凋亡和外基质缺失是KOA病程进展的关键环节[2]。黄腐酚(xanthohumol)是从啤酒花中提取的天然多酚物质,约占啤酒花干质量的1%,具有抗氧化、抗癌等多种药理作用,中医临床中常用于治疗糖尿病、消化系统疾病等[3-4]。研究表明,黄腐酚对细胞凋亡和自噬水平均有影响[5]。本研究通过建立KOA大鼠模型,探讨黄腐酚对KOA大鼠软骨损伤的修复作用和对软骨细胞自噬水平的影响及其可能的作用机制,旨在为黄腐酚药物开发及临床治疗骨关节炎提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Bio-Tek Elx800型全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司);CFX Connect型荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 试药

黄腐酚(质量分数为98%,批号B20557,规格为20 mg,上海源叶生物科技有限公司);硫酸氨基葡萄糖胶囊(维固力胶囊,规格为0.25 g,罗达药厂);白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assy,ELISA)试剂盒均购自英国Abcam公司;兔抗β-actin多克隆抗体、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、哺乳动物雷帕霉菌靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、哺乳动物ATG同源蛋白(mammalian ATG homologous protein, Beclin 1)、微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3-Ⅱ)多克隆抗体和山羊抗兔二抗免疫球蛋白G(immunoglobulin,IgG)均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 实验动物

60只7～8周龄SPF级雄性SD大鼠,动物来源于河北医科大学实验动物中心,合格证号为SCXK(冀)2020-002。体质量为220～250 g,所有大鼠于相同环境饲养,用标准饲料和清洁水源喂养7 d,定期更换垫料,保持良好通风。环境条件设置为温度20～24 ℃、相对湿度(50%±10%)。

2 方法

2.1 KOA大鼠模型建立

适应性饲养7 d后,选取48只大鼠用前后交叉韧带断离术建立KOA模型[6],腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,仰卧位固定于手术台上,选取两侧膝关节内侧部位,将手术部位腿毛剃除并消毒,无菌条件下纵向切开皮肤,暴露出整个膝关节,找到髌腱内缘切开关节囊,钝性分离结缔组织、血管,弯曲膝关节,切断前交叉韧带,切除内侧半月板,保留关节软骨面以避免损伤。用生理盐水冲洗关节腔,抽屉实验阳性后快速止血,逐层缝合手术伤口,无菌包扎。术后连续3 d注射青霉素,预防感染,每日驱赶大鼠迫使其运动30 min,观察大鼠状态,出现膝关节肿胀、行走不便或跛行,表示建模成功。

2.2 分组与给药

将造模成功大鼠随机分为模型组、黄腐酚低剂量、黄腐酚高剂量组和西药组;其余大鼠作为对照组(12只)。参照文献方法[7-8],黄腐酚低剂量、高剂量组分别灌胃50、100 mg·kg-1黄腐酚混悬液(用生理盐水配制),西药组灌胃0.17 g·kg-1硫酸氨基葡萄糖胶囊,对照组及模型组给予等量生理盐水,各组每日给药1次,连续给药28 d。

2.3 标本采集

末次给药后禁食24 h,腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,开腹,经腹主动脉采集血液,静置30 min,于4 ℃以3 000 r·min-1离心15 min(离心半径为12 cm),分离血清,-20 ℃保存。采血完毕后,脊椎脱臼法处死大鼠,分离左侧膝关节,剔除周围肌肉和脂肪组织,取出软骨组织,剪取部分置于无菌冻存管中,-80 ℃保存备用,其余软骨组织置于4 g·mL-1多聚甲醛液中固定24 h,备用。

2.4 大鼠软骨组织Mankin’s评分

将制好的软骨组织切片置于光学显微镜下观察形态变化,根据软骨组织结构完整性、软骨细胞数量和潮线完整性,用Mankin’s软骨损伤组织学评定标准对大鼠关节软骨组织病变程度进行评分,各分数相加为最终得分。评分越高表示KOA病变的程度越严重,详细评定标准见表1。

2.5 血清炎症因子水平检测

按照IL-6、IL-1β和TNF-α试剂盒说明书操作。取出相关板条,设置样品孔与标准孔,样品孔加入待测样本10 μL和稀释液40 μL,标准孔中加入不同质量浓度对照品稀释液50 μL。于各板孔中再加入酶标抗体100 μL,37 ℃水浴锅加热60 min,弃液拍干吸去多余液体后,各板孔中加入显色A液和B液各50 μL,37 ℃水浴锅加热10 min。最后加入终止液50 μL,用酶标仪在450 nm波长处检测各孔吸光度值,根据对照品梯度质量浓度绘制对照品线性回归曲线,计算各样本的质量浓度。

2.6 软骨组织HE染色观察

将固定24 h的软骨组织取出,置于脱水盒中脱去组织水分,二甲苯中透明。完全浸入石蜡中包埋,-20 ℃冷冻台冷却凝固,修整蜡块切成厚5 μm的薄片。切片放入二甲苯、无水乙醇和梯度乙醇溶液中进行脱蜡复水,浸入苏木精染色液10 min,流水冲洗1 min,盐酸分化1 s,氨水返蓝后再次用流水冲洗,伊红染液染色2 min,清水冲洗3 min,脱水透明,滴加中性树脂封固,保存。在光学显微镜下观察软骨组织病理变化并拍照。

2.7 软骨组织TUNEL染色观察

室温下将软骨组织切片浸入二甲苯脱蜡5 min,浸入梯度体积分数乙醇脱水3 min,PBS润洗切片,严格按照TUNEL试剂盒说明书操作,吸干多余液体后滴加配制好的20 μg·mL-1Proteinase工作液100 μL,室温孵育20 min,PBS冲洗,再加入显色剂,封膜孵育20 min,PBS冲洗3次,复染后封片,光学显微镜下移动切片观察软骨组织神经细胞凋亡情况,用Image J软件处理数据,统计细胞总数和呈现棕黄色的凋亡阳性细胞数,计算细胞凋亡率。细胞凋亡率=(阳性细胞数量/总细胞数量)×100%。

2.8 RT-PCR检测mRNA表达

取出软骨组织,按照RNA提取试剂盒说明书操作提取总RNA,用分光光度计检测RNA的质量浓度。按照反转录试剂盒说明书配制逆转录体系合成cDNA。用cDNA配制PCR反应体系(19.2 μL)。上、下游引物各0.4 μL,SYBR Premix Ex Tap 10 μL,ROX Refermce Dye Ⅱ 0.4 μL,cDNA 2 μL,RNase free ddH2O 6 μL。反应条件为95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 35 s,40个循环。取样本CT值平均数,以目的基因相对内参的表达量计算各样本中基因的相对表达水平,2-△△CT为各样本基因的表达水平。引物序列为PI3K-F: 5′-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3′、PI3K-R: 5′-GGCTACAGTAGTGGGCTTGG-3′;Akt-F:5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′、Akt-R:5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′;mTOR-F:5′-CAGTTCGCCAGTGGACTGAAG-3′、mTOR-R:5′-GCTGGTCATAGAAGCGAGTAGAC-3′;以β-actin为内参,β-actin-F: 5′-GGCTGTATTCCCCTCCAT-CG-3′、β-actin-R: 5′-CCAGTTGGTAACAATGCC-ATGT-3′。

2.9 Western blotting检测蛋白表达

取软骨组织,加入RIPA细胞裂解液进行裂解,制成匀浆后提取总蛋白,用BCA蛋白质量浓度试剂盒测定质量浓度。按照蛋白上样量为40 μL,加入配制好的分离胶与浓缩胶,恒压75 V电泳40 min,恒压120 V电泳至溴酚蓝及Marker位置即停止。转至PDVF膜,TBST漂洗5 min,加入脱脂牛奶于摇床中封闭2 h,再加入1∶1 000稀释一抗,于4 ℃摇床孵育,TBST漂洗5 min,加入1∶2 000稀释二抗,室温摇床封闭60 min,TBST漂洗,滴加显影液进行显影,避免曝光,保存图像,以β-actin为内参,观察条带上相应的蛋白表达量并对目的条带吸光度值进行计算、分析。

2.10 统计学方法

3 结果

3.1 软骨组织学评分比较

与对照组比较,模型组大鼠Mankin’s评分升高(P<0.05)。与模型组比较,3个给药组大鼠的Mankin’s评分均降低(P<0.05)。与黄腐酚低剂量组比较,黄腐酚高剂量组和西药组大鼠Mankin’s评分均降低(P<0.05),后2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 大鼠软骨组织学Mankin’s评分的比较

3.2 血清炎症因子水平比较

与对照组比较,模型组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高(P<0.05)。与模型组比较,3个给药组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05)。与黄腐酚低剂量组比较,黄腐酚高剂量组和西药组大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低(P<0.05),后2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血清炎症因子水平的比较

3.3 软骨组织HE染色比较

结果显示,对照组大鼠膝关节软骨组织形态未见明显异常,结构完整,软骨表面光滑,基质均匀,细胞形态正常、排列整齐,各层细胞均未见破坏,未见细胞肿胀和炎性细胞浸润等现象。模型组大鼠关节软骨组织结构破坏严重,软骨浅层出现明显缺失及裂缝,裂隙深达钙化层,深层细胞排列紊乱,潮线破坏情况严重,可见大量细胞增生,炎性细胞浸润。3个给药组大鼠关节软骨组织结构受损现象得到改善,表层逐渐平整光滑,结构清晰,偶见微小裂隙,软骨细胞及细胞核形态正常且排列整齐,细胞肿胀和增生情况减少,炎性细胞明显减少。见图1。

注:A.对照组;B.模型组;C.黄腐酚低剂量组;D.黄腐酚高剂量组;E.西药组。

3.4 软骨组织细胞凋亡率比较

与对照组比较,模型组大鼠软骨细胞凋亡率升高(P<0.05)。与模型组比较,3个给药组大鼠软骨细胞凋亡率降低(P<0.05)。与黄腐酚低剂量组比较,黄腐酚高剂量组和西药组大鼠软骨细胞凋亡率降低(P<0.05),后2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4、图2。

注:A.对照组;B.模型组;C.黄腐酚低剂量组;D.黄腐酚高剂量组;E.西药组。

表4 各组大鼠软骨组织细胞凋亡率的比较

3.5 mRNA水平比较

与对照组比较,模型组大鼠软骨组织PI3K、Akt和mTOR mRNA的表达水平升高(P<0.05)。与模型组比较,3个给药组大鼠软骨组织PI3K、Akt和mTOR mRNA的表达水平降低(P<0.05)。与黄腐酚低剂量组比较,黄腐酚高剂量组和西药组大鼠软骨组织PI3K、Akt和mTOR mRNA的表达水平降低(P<0.05),后2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

表5 PI3K、Akt和mTOR mRNA水平的比较

3.6 蛋白水平比较

与对照组比较,模型组大鼠软骨组织PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表达水平升高,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平降低(P<0.05)。与模型组比较,3个给药组大鼠软骨组织PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表达水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平升高(P<0.05)。与黄腐酚低剂量组比较,黄腐酚高剂量组和西药组大鼠软骨组织PI3K、p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白的表达水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平升高(P<0.05),后2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表6、图3。

注:A.对照组;B.模型组;C.黄腐酚低剂量组;D.黄腐酚高剂量组;E.西药组。

表6 PI3K、Akt、mTOR、Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平的比较

4 讨论

关节软骨属于透明软骨,能减少相邻两骨之间的摩擦,对缓冲运动时产生的压力起重要作用。KOA的发病机制较为复杂,研究表明其发病不仅是因为关节退化,而且与关节软骨细胞凋亡与自噬水平、滑膜和关节周围组织均存在密切联系[9]。KOA虽属于慢性退化疾病,病程较为缓慢,但前期若不及时给予药物干预,会引起膝关节功能丧失,产生严重形变,后期疼痛会严重影响患者的生活质量[10]。此外,KOA还会大大增加患者患心血管疾病的风险[11]。黄腐酚具有抗癌、减脂和保护心血管的作用[12-13]。黄腐酚作为高效氧化活性的生物成分,可通过调控细胞自噬相关通路蛋白的水平来抑制细胞凋亡[14]。用前后交叉韧带断离术建立KOA模型准确性高、干扰因素少、造模时间短、成本低,通过改变关节内平衡状态造成关节受力失衡诱发KOA,其病程与人类KOA相似[15]。故本研究用前后交叉韧带断离术建立KOA大鼠模型,从分子机制上探讨黄腐酚对关节炎大鼠软骨细胞自噬水平的影响。结果显示,模型组大鼠软骨组织学Mankin’s评分和血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平及细胞凋亡率均升高,表明模型组大鼠软骨组织受到损伤且伴有炎症反应,KOA模型建立成功。不同剂量黄腐酚和西药治疗后大鼠均表现软骨组织学Mankin’s评分和血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平及软骨细胞凋亡率降低,表明大鼠软骨组织损伤得到修复,软骨细胞的凋亡得到抑制,炎症反应明显减轻。此外,软骨组织HE染色结果也表明软骨结构受损现象得到改善,细胞肿胀、炎性细胞浸润现象减少,进一步验证黄腐酚对软骨组织的修复作用。

自噬是细胞实现自身代谢和细胞器更新的重要方式,细胞通过自噬降解残余蛋白和老化细胞器,为其他生理活动提供能量[16]。mTOR蛋白是调控细胞自噬水平的重要通路之一,在调控炎症反应时,mTOR可作为关键靶蛋白,对自噬水平进行调控[17-18]。PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活后,会影响多个下游因子的活化状态[19],抑制细胞自噬水平,Beclin 1作为自噬水平的负调控因子,高度参与细胞自噬水平的调控过程[20]。在本研究中,模型组大鼠软骨组织PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达水平和PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达水平均升高,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平均降低,表明模型组大鼠PI3K/Akt/mTOR信号通路被激活后,Beclin 1的表达被抑制,细胞自噬水平下降,软骨细胞凋亡率升高,引起软骨损伤。与模型组比较,黄腐酚各剂量组和西药组大鼠软骨组织PI3K、Akt、mTOR mRNA的表达水平和PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表达水平降低,Beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白的表达水平升高,可见黄腐酚能够抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路、提高细胞自噬水平、抑制软骨细胞凋亡,对大鼠软骨损伤有积极影响。

综上所述,黄腐酚能够提高KOA大鼠细胞自噬水平、减轻炎症反应、抑制软骨细胞凋亡,可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥作用的,可为临床治疗KOA提供实验依据。