两种糖尿病脑病动物模型建立及应用

林海容 许永劼 陈钢 许雯 黄昶煜东 韦思佳 杨婷婷 李兴 潘卫,3

(贵州医科大学 1附属医院产前诊断中心,贵州 贵阳 550004;2医学检验学院;3公共卫生学院;4贵州中医药大学)

糖尿病脑病(DE)是糖尿病导致中枢神经系统(CNS)功能障碍和认知下降的一种严重并发症〔1〕,临床上主要表现为注意力下降、学习记忆能力减退和认知功能障碍等〔2〕,严重认知障碍的糖尿病患者将发展为不可逆转痴呆〔3〕。DE的发病机制复杂,包括胰岛素抵抗与信号转导通路受损、炎症与线粒体功能障碍、氧化应激及细胞凋亡等。有研究发现,海马神经元凋亡会导致衰老大鼠的学习和记忆障碍〔4〕。此外,越来越多的证据表明,糖尿病大鼠海马神经元凋亡导致记忆障碍。本课题组前期研究也发现高糖能诱导海马神经元细胞的凋亡。

DE认知功能障碍的分子机制等方面已被广泛研究,但仍然不够完善,防治仍有欠缺〔5,6〕,而动物模型是DE临床与基础研究工作中必不可少的工具〔7〕。已有研究通过采用自发性Ⅱ型糖尿病小鼠建立DE模型、链脲佐菌素(STZ)诱导SD大鼠建立Ⅰ型DE模型、高脂饮食联合STZ诱导Ⅱ型DE模型等〔8～10〕,研究DE的发病机制,但是单纯选用Ⅰ型或Ⅱ型DE模型进行研究,并不能够完全模拟人类DE发生发展过程。因此,本实验选用STZ诱导SD大鼠构建Ⅰ型DE模型和db/db小鼠构建Ⅱ型DE进行联合分析,以期了解两种脑病模型的应用优势及缺点,为今后研究DE选择动物模型提供参考。

1 材料和方法

1.1实验动物 由贵州医科大学动物中心提供体质量180～220 g 的健康清洁级雄性SD大鼠〔SCXK(黔)2014-0010〕用于Ⅰ型DE模型;购自南京君科生物工程有限公司,8～9周龄,体质量38～41 g 的雄性健康清洁级db/db小鼠和体质量18～22 g的雄性健康清洁级db/m小鼠[SCXK(苏) 2016-0010]用于Ⅱ型DE模型。动物被安置在温度22～25 ℃,湿度50%～60%的房间内,12 h的光照周期中随时使用食物和水。在实验期间,通过贵州医科大学动物伦理委员会审查(IACUC-2017-006)。实验中,严格按照《实验动物关爱和使用指南》给予实验动物人道关怀。

1.2主要试剂与仪器 链脲佐菌素购自美国Sigma公司;0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液购自索莱宝公司;血糖仪及试纸条购自美国强生公司;JA2003N型电子天平购自上海菁海仪器有限公司;Morris 水迷宫购自中国医学科学院药物研究所;SMART 3.0小动物行为学记录分析系统购自西班牙Panlab;透射电子显微镜购自日本HITACHI HT7700;酶标分析仪购自Rayto RT-6100;Western印迹电泳仪购自美国Bio-Rad公司;冷冻离心机购自美国Beckman公司;摇床购自江苏其林贝尔仪器制造有限公司。

1.3动物模型

1.3.1Ⅰ型DE模型的复制 SD大鼠适应性喂养7 d后,用Morris水迷宫检测认知功能,挑选10只正常的大鼠为Ⅰ型对照组、10只为Ⅰ型DE组。实验开始前,大鼠被禁止食物12 h,Ⅰ型DE组根据体质量给予50 mg/kg STZ进行腹腔注射,对照组每只大鼠给予等剂量0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液进行腹腔注射,并从注射后开始,于3 d、1 w、3 w三次取尾静脉血检测随机血糖,随机血糖值连续3 w均≥16.7 mmol/L,达到DE大鼠模型复制成功标准,视为DE模型复制成功,后继续饲养大鼠模型2个月。

1.3.2Ⅱ型DE模型的建立 适应性饲养小鼠7 d后,测随机血糖,运用Morris水迷宫检测认知功能,挑选10只正常db/m小鼠为Ⅱ型对照组、10只db/db小鼠为Ⅱ型DE组,继续饲养16 w。

1.3.3体质量及随机血糖的测定 Ⅰ型DE组在实验开始前、造模后72 h、1、3、8、12 w时检测体质量,尾静脉取血测随机血糖;Ⅱ型DE组在实验开始第1、5、9、13、17周时检测体质量,尾静脉取血测随机血糖。

1.4行为学实验

1.4.1Morris水迷宫实验 Morris水迷宫由一个恒温水池和一个站台组成。其中,水池形状为圆柱形,直径160 cm(大鼠)、80 cm(小鼠),高50 cm,内壁涂成黑色;可移动站台直径12 cm。实验开始前,向水池放入清水,以水位高25 cm为宜,db小鼠实验时需加入奶粉使池水变为乳白色,水池水位高出站台0.5 cm,在水池内壁上做好标记,即每次实验动物的入水点。动物在水迷宫中接受了为期4 d的训练,每天进行4个60 s的实验,如果60 s内没有找到站台,则被引导到站台上,并被允许在站台上休息15 s。每1 d的起点顺序在不同动物之间是一致的,但1 d之间的顺序不同。在最后一次训练后约1 h进行,结束后1 h,将站台移走,将动物从新入水点放入水池里,实验长度为60 s,测量游泳轨迹、找到站台的时间和游泳速度,对每只动物4个象限的日均测量值进行平均化。

1.4.2Y迷宫实验 Y迷宫共3个臂,各臂夹角为120 °,每一臂尺寸为300 mm×80 mm×150 mm(小鼠)、425 mm×145 mm×225 mm(大鼠),内壁为黑色,在中央处各有一个可移动隔板。使用SMART 3.0系统进行图像采集分析。每只动物在一个面向迷宫中心的臂末端放置,允许其在迷宫内自由活动5 min,记录动物进入的臂总数和顺序。

1.4.3旷场实验 大鼠旷场反应箱高30 cm,边长100 cm,小鼠旷场反应箱高25 cm,边长50 cm,内壁涂黑,将实验动物放入反应箱中央区,允许自由活动5 min,记录进入中央区次数、后肢站立次数和运动距离。

1.5苏木素-伊红(HE)染色观察海马神经元形态变化 将分离后的海马迅速置于装有甲醛溶液的管子中固定24 h以上,进行石蜡包埋,切片、染色、封片,然后放入切片盒内,所有染片在光镜下观察并拍片。

1.6透射电镜观察海马组织超微结构 将分离后的海马组织(切片厚度70 nm)迅速在预冷的2.5%戊二醛固定液中固定2 h,制作切片,用HT7700透射电镜观察神经元细胞超微结构。

1.7血清白细胞介素(IL)-1β和IL-18的含量测定 DM组动物出现认知功能障碍后,心脏取血,3 000 r/min离心5 min,收集血清,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中IL-1β、IL-18的含量。实验严格按照说明书进行操作。

1.8Western印迹检测各组动物海马组织B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达水平 取海马组织,按照课题组之前的方法〔11〕提取总蛋白,采用二喹啉甲酸(BCA)法定量蛋白浓度。将蛋白样品(35 μg)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离在10%凝胶上,然后将目的蛋白转移0.45 μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,脱脂牛奶封闭2 h后加入兔多抗Bcl-2(1∶2 000)、Bax(1∶2 000),在振荡器上4 ℃孵育过夜,然后将膜在TB冲洗液中进行3次10 min漂洗,再在羊抗兔二抗(1∶10 000)孵育2 h后,将膜在TB冲洗液中进行3次10 min漂洗,电化学发光(ECL)法显色,用ImageJ软件对图片进行分析,得到灰度值,按照公式计算各组目的蛋白的相对表达量。

1.9统计学方法 采用GraphPad Prism8.0软件对正态分布的计量资料进行t检验。

2 结 果

2.1一般情况 Ⅰ、Ⅱ型对照组饮食饮水正常,毛发光亮,动作敏捷,精神状态良好;Ⅰ、Ⅱ型DE组精神萎靡不振,动作迟缓,毛发发暗且有脱毛现象,饮食饮水增加,尿量增加。

2.2体质量与随机血糖变化情况 与Ⅰ型对照组比较,Ⅰ型DE组腹腔注射STZ后72 h、2、3、7、12 w体质量明显下降(P<0.05)并趋于稳定,血糖明显升高(P<0.05)并保持在16.7 mmol/L 以上。与Ⅱ型对照组比较,Ⅱ型DE组自第9周起体质量及血糖均明显升高(P<0.05)。见表1。

表1 两种模型动物体质量与随机血糖变化

2.3Morris水迷宫 与对照组比较,Ⅰ型和Ⅱ型DE组动物游泳速度变慢,逃避潜伏期延长,穿越平台的次数减少,差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组Morris 水迷宫、Y迷宫及旷场实验

2.4Y迷宫 与对照组比较,Ⅰ型及Ⅱ型DE组动物自发交替率明显降低,且进入新异臂的次数明显减少(均P<0.05)。见表2。

2.5旷场实验 与对照组比较,Ⅰ型及Ⅱ型DE组动物运动总路程明显缩短,进入中央区次数和后肢站立次数显著减少(均P<0.05)。见表2。

2.6HE染色观察海马神经元形态变化 对照组海马CA1区锥体细胞形态规则,胞体丰满,排列整齐有序,细胞核蓝染,核仁明显。Ⅰ型DE组海马CA1区锥体细胞形态不规则,排列疏散,部分神经元坏死,细胞核淡染;Ⅱ型DE组海马神经元形态未观察到明显异常。见图1。

图1 各组海马神经元形态(HE染色,×200)

2.7海马组织透射电镜结果 对照组海马神经元细胞胞质内广泛分布内质网,线粒体结构完整,线粒体嵴明显,细胞核大小正常,核膜清晰,染色质分布均匀,神经纤维区富含突触,结构正常;两种DE组海马神经元细胞胞质中内质网和线粒体数量减少,出现脱粒和肿胀,细胞核明显收缩,核膜增厚,突触结构被破坏,数量减少。见图2。

图2 透射电镜观察各组海马神经元超微结构(×10 000)

2.8血清IL-1β、IL-18水平 两种DE组血清中促炎因子IL-1β、IL-18水平显著高于各自对照组(均P<0.05)。见表3。

表3 各组血清IL-1β、IL-18水平比较

2.9Western印迹检测各组海马组织Bax、Bcl-2表达水平 与对照组比较,两种DE组海马组织凋亡相关蛋白Bax表达显著增加,Bcl-2表达显著降低(均P<0.05)。见表3、图3。

图3 Western印迹检测各组Bax、Bcl-2表达

3 讨 论

理想的动物模型是DE研究的基础,应该能够完全模拟人类DE发生发展过程,模型制作简单,诱导因素单一,重复性好,可引起DE,并尽可能避免其他因素对认知功能障碍指标的干扰。临床上最常见的糖尿病类型主要是Ⅰ型及Ⅱ型,DE是糖尿病慢性并发症之一,是糖尿病患者葡萄糖代谢紊乱导致脑血管发生改变,进而损害中枢神经系统,导致大脑结构、神经生理和神经精神等的病理改变〔12〕。在糖尿病患者中,Ⅱ型糖尿病占90%以上〔13〕,已有大量研究采用Ⅱ型DE模型探究DE可能的发病机制及治疗药物的筛选〔14～17〕。Ⅰ型糖尿病多发于儿童、青少年,且其发病率在世界范围内呈上升趋势,建立临床相关的脑病动物模型对Ⅰ型DE研究具有重要意义。本课题组前期构建Ⅰ型DE模型为DE研究提供参考方法,不论是Ⅰ型还是Ⅱ型DE模型都不能完整呈现DE的发病机制。因此,从全面性和系统性角度考虑,本研究在实验中同时选用Ⅰ型和Ⅱ型DE模型进行研究。

动物行为学评估在认知功能障碍相关疾病的动物模型评估中具有重要作用〔18～20〕。Morris水迷宫测试是目前评估动物空间认知功能最为常用的研究方法,这种方法利用动物喜水的天性,强迫其尽快找到水下站台,来测试其记忆能力和空间学习,但是这种方法是强迫性的,会引起实验动物的情绪反应,可能会影响评估结果〔21〕。每种行为学实验的侧重点与使用条件不一样,在实验中,仅通过动物的一种行为学测试表现是不可能准确评估学习和记忆相关的信息,因为受试者可能会被与认知能力无关的其他信息干扰,必要时结合多种行为学方法进行综合分析,为认知功能障碍相关研究提供科学可靠的依据〔22〕。因此,本实验选用了Morris水迷宫、Y迷宫和旷场实验等多种行为学实验综合分析动物的认知功能。多种行为学测试结果明确提示,Ⅰ型DE模型组在发病8 w时和Ⅱ型DE模型组在25周龄时与对照组动物确实存在表现差异。

海马是学习和记忆的中枢,神经元细胞的凋亡和损伤会引起认知功能的障碍〔23～25〕。本实验显示,Ⅰ型和Ⅱ型模型组动物海马组织凋亡Bax/Bcl-2蛋白水平显著升高,且Ⅰ型模型大鼠海马神经元细胞排列松散、空泡化明显、细胞数量减少,这与行为学实验结果相符;而Ⅱ型模型小鼠海马神经元细胞无明显异常,可能由于该时期认知功能障碍属于早期。因此,如需观察严重的认知功能障碍,Ⅱ型DE模型小鼠还需继续饲养一段时间。

综上所述,两种DE模型作为经典模型,在一定程度上均模拟了临床DE认知功能障碍的病症特点,两种模型之间各有优缺点,适合不同的实验需求。Ⅰ型DE模型大鼠价格低廉,成模时间短,但个体差异大,在喂养过程中,由于高血糖导致大鼠抵抗力变差,进而出现较高死亡率;Ⅱ型DE模型稳定,但价格偏贵,成模需要的时间较长,饲养的条件要求较严格、繁殖率低,且人类糖尿病患者很少发生瘦素受体基因缺失,因此db/db小鼠不能完全模拟人类DE发生过程,其用于DE病因学研究有一定的局限性,可用于DE干预治疗研究的模型。若课题组经费充足且实验条件允许,建议同时选用两种DE模型进行研究,这样更能完整模拟人类DE的发生发展过程。实验中应根据研究目的,结合不同模型的特点,选择适合的动物模型,从而有助于课题的实施和完成。