m6A 修饰在慢性疼痛中的研究进展 *

吕 楠 吕志峰

（1 河南中医药大学第一临床医学院，郑州 450046；2 河南中医药大学第一附属医院麻醉科，郑州 450000）

慢性疼痛是指持续时间超过3 个月的疼痛，目前也被视为一种疾病而非疾病所伴随的状态，受其困扰的人群仅我国已超过3 亿，并且每年增幅超过千万[1]。慢性疼痛加重病人个人、家庭乃至整个社会的负担，已然成为亟待解决的公共卫生问题。随着对疼痛研究的深入，DNA 甲基化、组蛋白修饰等表观遗传修饰已被证实参与慢性疼痛的发生发展，其中N6-甲基腺苷 (N6-methyladenosine, m6A) 是真核生物RNA 内部最普遍的修饰类型[2]。正是由于第一个m6A 去甲基化酶—脂肪含量与肥胖相关蛋白(fat mass and obesity-associated protein, FTO) 的发现与m6A 高通量测序技术 (m6A-seq) 的发展，使人们意识到m6A 是一种动态可逆的修饰过程并在生物学中发挥重要作用。诸多证据表明[3,4]，m6A 修饰在不改变基因序列的前提下凭借其动态变化调控多种生理病理过程，包括神经调节、免疫激活、肿瘤侵袭等，并且与慢性疼痛关系密切。本文围绕m6A 与RNA的关系、m6A 相关调控蛋白、m6A 在慢性疼痛中的作用三方面进行综述，以总结国内外科研工作者们对m6A 修饰的最新认识及其在慢性疼痛领域最新的研究成果，旨在完善慢性疼痛作用机制并为其治疗提供部分理论依据。

一、m6A 与RNA 的关系

m6A 是指在RNA 腺嘌呤第6 位N 上发生的甲基化修饰。m6A 修饰相对保守，大多发生于DRACH序列的腺嘌呤中，其中D 代表A/G/U，R 代表A/G，H 代表A/C/U。约有94.5%的m6A 修饰都发生在mRNA 上，其大多数富集在mRNA 的蛋白质编码区和非翻译区 (untranslated region, UTR)，且m6A 修饰更集中在长外显子、终止密码子及3'UTR 区域[5]。此外，mRNA 被m6A 甲基化的特定位置也与基因表达相关，同时m6A 介导的基因表达调控也取决于转录物中m6A 的位置。虽然m6A 并不改变碱基序列的配对及编码，但却广泛参与mRNA 的剪接、稳定、出核、翻译及降解等过程。

m6A 也存在于非编码RNA (noncoding RNA,ncRNA) 中，目前相关研究多集中于微小RNA (microRNA, miRNA)、长链非编码RNA (long noncoding RNA, lncRNA) 以及环状RNA (circular RNA, circRNA) 。微处理器复合体 (DiGeorge critical region8,DGCR8) 通过识别miRNA 初级体 (primary miRNA,pri-miRNA) 上的m6A 修饰位点实现对miRNA 的加工生成，使得miRNA 发挥生物学功能[6]。与之不同，m6A 通过改变lncRNA 的空间结构及稳定性来调节其与RNA 结合蛋白 (RNA-binding proteins, RBP) 的结合能力，并且经过m6A 修饰后的lncRNA 可通过内源性竞争结合miRNA 位点进而促进下游mRNA的翻译[7]。此外，m6A 修饰同样参与circRNA 的表达与分布，并且影响其与miRNA 及RBP 的结合从而发挥对下游靶点的调控[8]。由此可见，m6A 修饰较多通过调节ncRNA 的结构和功能进而影响基因表达；同时ncRNA 还可通过影响m6A 相关调控蛋白来反向调节m6A 修饰。以上均表明m6A 修饰是介导遗传信息的新一层面，并可与其他表观遗传修饰协同发挥调控作用。

二、m6A 相关调控蛋白

与m6A 相关的调控蛋白包括：m6A 甲基转移酶 (writers)、m6A 去甲基化酶(erasers)以及m6A 结合蛋白 (readers)。writers 与erasers 协同调控m6A 的动态可逆性修饰过程，而readers 通过识别m6A 修饰位点继而发挥生物学功能，三者协作使m6A 甲基化水平与生物整体状态相适应。m6A 相关调控蛋白及主要作用机制见表1。

表1 m6A 相关调控蛋白及作用机制

1.m6A 甲基转移酶

m6A 修饰的发生依赖甲基转移酶，writers 是一个复合物，主要由甲基转移酶样蛋白3 (methyltransferase-like 3, METTL3)、甲基转移酶样蛋白14 (methyltransferase-like 14, METTL14)、辅 助 因子Wilms 肿瘤1 相关蛋白 (Wilms tumor 1-associated protein, WTAP) 三个核心成分组成。METTL3 通过结合催化S-腺苷甲硫氨酸 (S-adenosyl methionine,SAM) 为甲基供体，在细胞核发挥甲基化作用；而METTL14 则与METTL3 结合形成复合物以提高酶的活性；WTAP 则是促进复合物与目标RNA 结合发挥生物学功能[9]。

然而，近年来对writers 复合物的组成还有很多新发现。RNA 结合基序蛋白15 (RNA binding motif protein 15, RBM15) 和其同源物RBM15B 含有RNA结合结构域，使writers 复合体能够与mRNA 特定位点结合，起到招募作用[10]。病毒样m6A 甲基转移酶相关蛋白(vir-like m6A methyltransferase associated protein, VIRMA)也称KIAA1429，指导writers复合物进行选择性甲基化，并优先使3'UTR 和终止密码子发生m6A 修饰[11]。锌指CCCH 结构域蛋白13 (zinc finger CCCH domain-containing protein 13,ZC3H13) 与WTAP 发挥协同作用使复合物准确定位到细胞核并发生甲基化，敲除ZC3H13 可显著降低mRNA 的整体m6A 水平[12]。E3 泛素连接酶Casitas B 系淋巴瘤原癌基因转化序列样蛋白1 (Casitas B-lineage lymphoma-transforming sequence-like protein 1, CBLL1) 也称HAKAI，是m6A writers 的核心成员之一，其与WTAP/Fl(2)d-VIRMA/Vir-ZC3H13/Flacc形成一个稳定的复合物，整合环境和细胞信号。HAKAI 突变则会破环复合物亚基的稳定性，进而导致mRNA 中m6A 下调、与果蝇性别发育相关的Sxl 基因可变剪接发生异常[13]。

锌指蛋白217 (zinc finger protein 217, ZFP217)是一种具有保守锌指结构的转录因子，其与METTL3以非活性复合物的形式结合，可减少METTL3 与RNA相结合、防止METTL3 介导的m6A 异常甲基化；与此同时，ZFP217 还可以激活FTO 的表达来促进去甲基化，并且ZFP217 还可抑制YTHDF2 与m6A结合，以利于FTO 与mRNA 上m6A 位点结合、促进mRNA 的稳定性[14]。基于现有研究可知，writers复合物在介导m6A 修饰过程中发挥不可替代的作用，并且可能还存在更多的writers 有待挖掘。

2.m6A 去甲基化酶

m6A 是一种动态可逆的修饰过程，erasers 可以介导m6A 去甲基化修饰，包括FTO、ALKB 同源物5 (ALKB homolog 5, ALKBH5) 和ALKB 同源物3(ALKB homolog 3, ALKBH3)，它们同属于α-酮戊二酸依赖性双加氧酶。最近研究发现，FTO 不仅可以擦除m6A，还可以作用于核内小RNA (small nuclear RNA, snRNA) 擦除N6-2'-O-二甲基腺嘌呤 (m6Am)修饰，从而调节mRNA 的可变剪接；并且FTO 所作用的位置与其在细胞内的定位有关，FTO 在细胞核中是poly (A) RNA m6A、snRNA m6A 和m6Am 以及tRNA m1A 的去甲基化酶，而在细胞质中FTO 还介导poly(A) RNA m6Am 的去甲基化[15]。因此在探究FTO 去甲基化作用时，敏感且准确的实验检测方法显得至关重要。ALKBH5 与FTO 去甲基化过程大体一致，但不需要中间产物即可去除m6A 修饰，且更针对于单链RNA 的去甲基化，同时还介导调节mRNA 出核；而ALKBH3 对tRNA 具有更强的底物特异性[16]。总而言之，FTO、ALKBH5 和ALKBH3均通过擦除m6A 的修饰作用并相应地调节靶基因的翻译进而参与RNA 代谢及多种生理病理进程。

3.m6A 结合蛋白

m6A 修饰的识别由m6A 结合蛋白介导并发挥其功能。目前发现的readers 主要包括：含YTH结构域蛋白、核不均一核糖核蛋白 (heterogeneous nuclear ribonucleoproteins, hnRNPs)、胰岛素样生长因子2-mRNA 结合蛋白 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding proteins, IGF2BPs) 及真核翻译起始因子3 (eukaryotic initiation factor 3, eIF3) 等。

含YTH 结构域的蛋白包括m6A YTH 结合蛋白1-3 (YTH N6-methyladenosine RNA binding protein 1-3, YTHDF1-3) 以及YTH 结构域蛋白1-2 (YTH domain-containing 1-2, YTHDC1-2) 。YTHDF1 通过与翻译起始因子相互作用，将含有m6A 的mRNA 招募到核糖体，从而促进翻译；YTHDF2 通过N-末端区域与去腺苷酶复合物CCR4-NOT 相互作用，介导含m6A 修饰的RNA 通过poly(A) 尾以去腺苷酸依赖性途径降解，从而抑制翻译；YTHDF3 可以分别与YTHDF1 和YTHDF2 协作，共同调控mRNA的翻译与降解[17]。YTHDC1 是细胞核内最主要的结合蛋白，其不仅优先且高效识别m6A 序列，还与丝氨酸/精氨酸富集剪接因子3 (serine and arginine rich splicing factor 3, SRSF3) 相互作用，最终通过核RNA 输出因子1 (nuclear RNA export factor 1, NXF1)促进mRNA 的剪接与出核，亦可调节靶基因的稳定及降解参与多种生物学反应[18]。YTHDC2 能够识别mRNA 编码区m6A 修饰的特殊二级结构，促进了结构化mRNA 的翻译；并且YTHDC2 还通过与5'-3'核糖核酸外切酶1 (5'-3' RNA exoribonuclease 1,XRN1) 相互作用参与靶mRNA 的降解[19]。hnRNPs包括hnRNPC、hnRNPG 和hnRNPA2B1，其中hn-RNPC 与hnRNPG 在细胞核中识别甲基化位点，调节mRNA 的成熟与丰度；而hnRNPA2B1 主要调控pri-miRNA 剪接加工为miRNA 前体 (pre-miRNA) ，影响miRNA 的生成[20]。IGF2BPs 包含IGF2BP1、IGF2BP2 和IGF2BP3，均为进化保守的RNA 结合蛋白，都含有K 蛋白同源结构域来识别m6A 修饰，具有维持mRNA 稳定性和翻译的作用，并且IGF2BPs 的稳定翻译作用与YTHDF2 的降解作用还相互制约，共同介导基因表达[21]。eIF3 可以直接与mRNA 5'UTR 上的m6A 修饰位点结合，促进翻译起始复合物募集至mRNA 上，以启动翻译过程[22]。

此外，脆性X 智力低下蛋白1 (fragile-X mental retardation protein 1, FMR1) 是一种核糖体蛋白，最近被证实能够识别并结合m6A 修饰的mRNA。FMR1 与mRNA 结合阻碍核糖体易位，阻止多肽延伸，起到翻译抑制作用；并且FMR1 还可抑制tRNA与核糖体的结合[23]。ELAV 样蛋白1 (ELAV-like protein 1, ELAVL1) 通过与YTHDC1 和IGF2BP1 等分子结合来协同促进mRNA 的稳定[24]。富含亮氨酸的五肽重复基序蛋白 (leucine-rich PPR motif-containing protein, LRPPRC) 通过调节由线粒体DNA 编码的mRNA 成熟，参与多种恶性肿瘤疾病进程，但具体分子机制尚不完全清楚[25]。由此可见，未来致力于结合蛋白的研究有益于在更深层面阐明m6A 修饰所介导的生物学功能。

三、m6A 在慢性疼痛中的作用

国际疾病分类第11 版(ICD-11)将慢性疼痛分为慢性原发性疼痛和慢性继发性疼痛两个大类。而在慢性疼痛的基础研究中，以对建立由外周或中枢神经损伤引起的慢性神经病理性疼痛 (neuropathic pain, NP) 和外周组织持续炎症状态引发的慢性炎症性疼痛的研究更为广泛。此外，基于m6A 修饰作用探讨肌肉骨骼疼痛的机制也备受关注。

1.m6A 与神经病理性疼痛

NP 是躯体感觉神经系统损伤或疾病导致的一类疼痛，以自发痛、触诱发痛及痛觉超敏为主要特点。免疫反应和神经炎症是诱发及维持NP 的关键因素[26]。但目前对其发病机制尚不完全清楚，且缺乏行之有效的治疗方案。

既往研究表明，FTO 可能通过正向调控背根神经节中的组蛋白甲基转移酶 (G9a) 来促进NP；而最近的研究发现，FTO 还可通过减少脊髓中基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)中MMP24的m6A 修饰，促进MMP24 蛋白表达，继而激活细胞外信号调节蛋白激酶 (extracellular signal regulated kinase, ERK) 磷酸化导致NP 反应，而p-ERK 也被广泛认为是脊髓神经元痛觉敏化的标志物[27]。有研究报道，脊神经结扎 (spinal nerve ligation, SNL) 小鼠脊髓内FTO 表达上调，METTL14 表达下调，进而导致趋化因子受体3 (chemokine receptor 3, CXCR3)的m6A 修饰水平降低；CXCR3 表达上调并介导肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6 (interleukin-6,IL-6) 表达量升高，从而使SNL小鼠的痛阈值下降[28]。以上结果均提示FTO 可能凭借其对m6A 的去甲基化作用通过多个靶点参与疼痛反应。另有数据证实，鞘内注射FTO 抑制剂可呈剂量依赖性地减轻SNL 所诱发的机械性痛觉超敏和温度刺激性痛觉过敏，其机制与下调G9a 从而上调mu 阿片受体 (opioid receptor, MOR) 以及电压门控钾离子通道kv1.2 有关[29]。由此可见，FTO 抑制剂可能对临床治疗慢性疼痛具有潜在价值。

有研究报道，在NP 大鼠中，METTL3 和YTHDF2显著下调，脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor, BDNF)显著上调，这可能与METTL3和YTHDF2 协同介导pri-miR-150 的m6A 修饰以及miR-150 靶向抑制BDNF 的表达有关。BDNF 是体内最丰富的神经营养因子，它通过与酪氨酸激酶受体B (tyrosine kinase receptor, TrkB) 结合，促进TrkB 自磷酸化，激活肾素-血管紧张素系统 (renin-angiotensin system, RAS) 、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK) 等多种途径，进而参与NP[30]。Bai 等[31]报告，Wnt3a/β-catenin 信号途径的异常激活可通过加强神经炎症反应，调节神经元突触可塑性及降低表皮神经纤维密度引发慢性疼痛。在奥沙利铂引起的NP 小鼠脊髓背角中Wnt3a 上调YTHDF1 的表达，并促使TNF-α 和白介素-18 (interleukin-18, IL-18) 大量产生，引发小鼠的疼痛反应；而沉默YTHDF1 基因可以下调TNF-α和IL-18 表达，缓解小鼠的疼痛行为。综上所述，外周及中枢等疼痛信号传导部位的m6A 修饰在NP进展中起重要作用，靶向m6A 的干预手段可能成为治疗NP 的新方法。

2.m6A 与炎症性疼痛

炎症性疼痛是由于创伤感染等原因导致组织受损并产生强烈的炎症反应而引起的疼痛。10-11 易位蛋白1 (ten-eleven translocation 1, TET1) 是一种DNA去甲基化酶，介导5-甲基胞嘧啶 (5mC) 向5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC) 转化，通过激活疼痛相关靶点信号转导和转录激活因子3 (signal transducers and activators of transcription 3, STAT3) 、代谢性谷氨酸受体5(metabotropic glutamate receptor 5, mGluR5) 的表达参与疼痛反应；TET1 还介导脊髓中miR-365-3p 的启动子5hmC 含量增加来促进自身表达，并通过靶向抑制电压门控钾离子通道Kv11.1 的表达来加强疼痛反应[32]。研究发现，在完全弗氏佐剂 (complete Freund's adjuvant, CFA) 诱导的慢性炎症性疼痛模型中，METTL3 与YTHDF2 协同调节TET1 参与炎症性疼痛；模型中同侧脊髓内METTL3 表达降低，减少了TET1 mRNA 的m6A 修饰并促进TET1 的表达；同时，YTHDF2 的表达下调减少了TET1 的降解，两者共同作用促进了疼痛反应；而过表达METTL3 和YTHDF2 则可逆转这一现象[33]。值得关注的是，METTL3 是RNA 甲基转移酶，TET1 是DNA去甲基化酶，两者共同参与伤害性信息的加工，这也说明表观遗传学是疼痛机制的重要组成部分，其内在的基因调控关系庞杂、需要深入挖掘探索。

但对于METTL3 在CFA 诱导的慢性炎症性疼痛中的表达及作用尚存争议，Zhang 等[34]报道，CFA 诱导脊髓神经元中METTL3 和总m6A 修饰水平显著增加，METTL3 促进pri-miR-365-3p 的m6A修饰，并增强了DGCR8 对pri-miR-365-3p 的识别结合，正向调控miR-365-3p 的成熟，从而下调钾离子通道Kv11.1 的表达介导疼痛敏化；而敲除METTL3基因可预防和逆转CFA 的作用。因此，对于慢性炎症性疼痛反应中m6A 相关酶的表达及其修饰水平的变化还需实验进一步验证，这也说明了表观遗传学介导疼痛过程的复杂性。

胶质细胞作为维持中枢系统稳态的免疫细胞已被证实参与慢性疼痛有关的神经炎症反应，特别是小胶质细胞的激活，而神经炎症反应也是中枢神经系统疾病的共同病理特征[35]。最近的证据表明[36]，小胶质细胞在发挥其促炎及抗炎作用中均有大量m6A 修饰，尤其在mRNA 和lncRNA 上存在多种差异。这些差异在促炎过程中，多体现于与免疫系统调节有关的细胞信号传导和蛋白质降解等途径；在抗炎过程中体现于遗传信息编码及细胞发育代谢等途径。m6A 修饰的调节与平衡介导小胶质细胞在静息稳态M0、经典激活M1 和替代激活M2 三者之间的转化，且已在缺血性脑损伤、抑郁症等神经系统疾病中得到验证，但其在疼痛反应中如何修饰并发挥何种作用尚未明确。由此，于小胶质细胞层面探讨m6A 修饰与炎症性疼痛的关系，相信对完善慢性疼痛的分子作用机制意义重大。

3.m6A 与肌肉骨骼疼痛

肌肉骨骼疾病是一类累及肌肉、软骨、骨、关节等部位的炎症相关性退行性疾病，包括椎间盘退变(intervertebral disc degeneration, IVDD) 、骨关节炎(osteoarthritis, OA)等，由其所导致的慢性疼痛已成为医疗卫生不容忽视的客观问题。IVDD 是腰背痛最常见的病因之一，有研究发现IVDD 病人髓核(nucleus pulposus, NP)中存在大量的METTL14并且会上调炎症小体复合物中NOD 样受体蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3) 的表达，增加IL-1β 和IL-18 的表达，最终导致髓核细胞 (nucleus pulposus cells, NPCs) 凋亡；而抑制METTL14 有利于维持NP 功能、延缓椎间盘退变的进展[37]。此外，METTL14 还促进pri-miR-34a-5p 的m6A 修饰、上调miR-34a-5p 表达，继而下调去乙酰化酶SIRT1(sirtuin 1) 从而加速NPCs 的衰老；而下调METTL14可以抑制细胞周期的停滞与衰老[38]。以上研究均提示METTL14 抑制剂可能成为延缓、治疗IVDD 的新型辅助药物。还有研究发现在衰老的NPCs 中，lncRNA 内由DNA 损伤激活的非编码RNA (non-coding RNA-activated by DNA damage, NORAD)的m6A 修饰显著增多，WTAP 表达上调；同时YTHDF2 介导lncRNA NORAD 大量降解，NORAD 的缺失使PUMILIO（高度保守的RBP，识别mRNA 序列抑制翻译）活性增强，抑制E2F 转录因子3 (E2F transcription factor 3, E2F3) 的表达，继而促进NPCs 衰老加重IVDD[39]。因此，调控lncRNA NORAD 的m6A 修饰水平很可能成为治疗IVDD 的新策略。

关节软骨的细胞代谢紊乱和细胞外基质 (extracellular matrix, ECM) 降解目前被认为是OA 发生发展的主要病理机制，其过程涉及转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)/SMAD、核 转录因子-κB (nuclear factor kappa B, NF-κB) 、MAPK等多条信号通路。Bertero 等[40]发现SMAD2/3 可以促进writers 复合物与SMAD2/3 特异性转录因子结合，破坏转录因子的稳定性，加速其降解，从而影响下游靶基因的表达和软骨细胞的活性。还有研究证实，OA 病人膝关节组织中METTL3 表达量减少，在以IL-1β 处理的SW1353 细胞炎症模型中，过表达METTL3 后，p65、p-ERK、MMP1 和MMP3 表达增加，TNF-α、IL-6、IL-8、组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1, TIMP-1)、组织金属蛋白酶抑制剂 (tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 2, TIMP-2) 及MMP13 表达量降低[41]。这也提示METTL3 可能通过调节炎症反应以及TIMPs与MMPs 之间的平衡来影响OA 中ECM 的降解，进而缓解OA 所致的疼痛反应。同样METTL3 和YTHDF2 等m6A 调控蛋白在类风湿性关节炎 (rheumatoid arthritis, RA) 中，也多数通过介导炎症、免疫相关信号通路及与RA有关的基因表达发挥作用[42]。m6A 修饰还可能直接参与影响滑膜细胞的增殖，这也为今后探究、治疗RA 疾病提供一种新思路。

四、小结与展望

综上所述，现有研究均证实m6A 修饰在炎症性疼痛、神经病理性疼痛以及与慢性疼痛相关的肌肉骨骼疾病的发生发展中存在显著变化并发挥重要作用，其通过调控疼痛相关炎症因子与基因表达，进而改变神经元兴奋性及突触可塑性，最终影响慢性疼痛。与此同时，多种m6A 调控蛋白的发现与鉴定，不断扩增的靶基因筛选，也在表观遗传学层面丰富了慢性疼痛机制。然而目前研究尚存在不足之处：首先，m6A 修饰并非疼痛相关区域所特有，在其他组织细胞中也有表达，关注与疼痛有关的特异性、减少与其他反应相关的干扰至关重要；其次，在未来可重复并增加一些慢性疼痛模型的研究，进一步可着重关注m6A 修饰和胶质细胞间的调节作用以及对慢性疼痛调控的时间进程及确切的因果关系；再者，探索发现与慢性疼痛相关的m6A 修饰标志物，也可作为临床预测、诊疗、评估疼痛的重要依据，然而此过程仍需要大量客观、标准的实验进行验证。深入探索m6A 修饰参与疼痛反应的作用机制，必将加快表观遗传学从理论靶点到临床应用的转化，从而改善慢性疼痛病人的生活质量及社会的经济负担。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。