酸碱胁迫对鳜存活率、组织结构及解毒酶活性的影响

张成硕,赵 岩,王艳玲,曾萌冬,赵金良

( 1.上海海洋大学,水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306; 2.上海海洋大学,水产动物遗传育种中心上海市协同创新中心,上海 201306 )

水体pH是影响鱼类生存、生长和繁殖的重要环境因素[1]。pH的高低也可以反应水质的变化情况(如水中藻类的活力、二氧化碳的存在状态等)。因此,pH作为养殖水体的重要水质指标而被广泛关注。淡水缓冲能力较差,养殖过程中饲料、药物的使用极易引起pH的变化。此外,不可控因素(如废水排放污染等)也会加剧水体的pH变化,进而影响鱼类生长或引起疾病的发生,甚至死亡。

鳜(Sinipercachuatsi)是我国传统的淡水名特优鱼类。鳜自从实现人工繁殖以来,其养殖规模不断扩大[2-3]。鳜对养殖水质要求较高,目前关于水体环境因子胁迫对鳜影响的研究主要涉及氨氮胁迫[4-6]、低氧胁迫[7]和酸碱胁迫[8-9]方面。酸碱胁迫的研究表明,平均体质量为25.0 g的鳜96 h耐受pH为4.1～9.1[8];鳜可以通过提高耗氧率来适应

酸碱胁迫[9]。细胞色素P450酶(CYP450)、黄素单加氧酶(FMO)、尿苷二磷酸葡醛酸转移酶(UGT)和谷胱甘肽S-转移酶(GST)是常见的抵御外界有毒化合物侵入体内的生物解毒酶[10]。酸碱胁迫可以引起上述解毒酶基因在鳜体内的表达变化[9],但鳜对酸碱胁迫的适应机制尚不清晰。鳃和肝脏是鱼类机体适应外界环境胁迫过程中重要的调节器官。环境胁迫通常会造成鱼类鳃组织上皮细胞肿胀甚至脱落、肝细胞出现空泡化等现象,这些形态结构的变化也体现了组织的功能[11-13]。酸碱胁迫下鳜组织结构变化特点尚无研究报道。

笔者观察了酸碱胁迫下鳜的存活率,鳃和肝脏组织学结构以及相关解毒酶的活性变化,旨在深入探究酸碱胁迫对鳜的影响及其相应适应机制,为其健康养殖及安全生产提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用鳜300尾,取自安徽省池州市秋浦特种水产开发有限公司,在实验室循环水族箱中至少暂养7 d,待其适应新环境。其间每日投喂饵料鱼,检查鱼的活动情况并及时清理残饵和粪便。暂养结束后,分为大规格[体质量(30.2±5.1) g]、小规格[体质量(5.3±0.7) g]两组。试验用水为曝气48 h以上的自来水,水温(24.6±0.5) ℃,pH 7.5±0.1,溶解氧(8.1±0.1) mg/L。试验容器为55.0 cm×40.0 cm×31.5 cm玻璃水族箱。

1.2 试验方法

1.2.1 试验液的配制

预试验中,以pH≤3、pH≥11为胁迫条件,发现大规格幼鱼组存活时间不超过72 h,不能在72 h内对活体进行连续采样,以pH 4.0、10.0胁迫,大规格幼鱼可存活72 h。正式试验中用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH调节试验液pH,设置pH分别为4.0、5.5、7.0、8.5、10.0的试验组。

1.2.2 酸碱胁迫试验

试验时,将试验鱼从水族箱内取出,直接放入试验组中。每组试验各放10尾同规格鱼,设3个平行。发现死鱼及时捞出,并记录死亡时间和尾数,统计不同时间段内存活率,最短、最长以及平均存活时间。由于小规格幼鱼组难以进行组织采样,所以仅对大规格幼鱼组进行组织采样。胁迫72 h后对试验鱼采样用于组织切片观察,并分别在胁迫后3、12、24、48 h和72 h采样用于酶活性测定。采样在灭菌操作台上操作,解剖后快速将试验鱼鳃、肝组织放入波恩氏液中或-80 ℃超低温冰箱保存。每组随机取2尾。试验期间不投喂饵料,试验开始后,每隔5 h调整试验液1次,充氧1 h,每隔24 h更换试验液。

1.2.3 组织切片

将试验鱼鳃、肝脏组织用0.9%生理盐水清洗后放入波恩氏液(福建飞净科研试剂)中固定24 h,用体积分数70%乙醇(国药集团化学试剂有限公司)对组织进行脱水45 min,使组织由黄色变为浅色后再分别用体积分数80%、90%、100%乙醇脱水40 min。脱水完成后先浸入二甲苯与乙醇体积比为1∶1的混合液中15 min,浸入纯二甲苯溶液中20 min直至透明完成。使用石蜡溶液浸入组织,进行包埋。使用Leica RM 2016轮转式切片机连续切片,厚度为5 μm,切好的组织切片烘干后经苏木精-伊红(上海索莱宝生物科技有限公司)染色,用中性树胶进行封片,在Olympus显微镜下观察成像。

1.2.4 酶活性测定

称量试验鱼鳃、肝样品约0.05 g,按照m(组织质量,g)∶V(溶液体积,mL)=1∶9比例加入磷酸缓冲盐溶液,离心管置于冰上操作,使用匀浆器充分匀浆后获得组织匀浆液,于4 ℃下以2500 r/min(离心半径7 cm)离心8 min后,移液枪吸取上清液测定酶活性。使用上海酶联生物科技有限公司的试剂盒,在BioTek Synergy 酶标仪中450 nm波长下检测组织中细胞色素P450酶、黄素单加氧酶、尿苷二磷酸葡醛酸转移酶、谷胱甘肽S-转移酶的活性。

1.3 数据分析

试验数据用SPSS 19.0统计进行分析,单因素方差分析进行显著性检验,邓肯多重比较检测各测量指标的差异,P<0.05认为具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 酸碱胁迫对鳜存活率的影响

各时间段内鳜存活率,最短、最长以及平均存活时间见表1。大规格幼鱼除取样外,在各试验组中72 h内无死亡个体,因此未统计开始取样(3 h)后的存活率。小规格幼鱼,在pH 5.5、7.0、8.5的试验组中72 h内存活率分别为93.3%、100%、100%,在pH 4.0、10.0中1 h内全部死亡,平均存活时间分别为(53.60±4.65) min和(49.30±5.34) min。

表1 pH胁迫鳜的存活率和存活时间Tab.1 Survival rate and time of S. chuatsi upon pH stress

2.2 酸碱胁迫对鳜鳃组织结构的影响

72 h后,pH 7.0组中,鳜鳃组织血细胞分布均匀,胞核明显,排列整齐,鳃小片结构完整清晰,长度、粗细均匀一致,黏液细胞胞体较大且明显,排列规则,层间细胞团与鳃小片之间无明显间隙,上皮细胞紧密包裹在鳃小片外围(图1a);pH 4.0组中,鳜鳃小片出现显著变化,变短变粗呈弯曲肿大状态,鳃丝处毛细血管破碎,血细胞沉积,血细胞排列密集且胞核较小,上皮细胞水肿甚至脱落(图1b);pH 5.5组中,鳜鳃丝血细胞排列杂乱无章,鳃小片之间的层间细胞团明显变薄,上皮细胞增生肿大(图1c);pH 8.5组中,鳜鳃丝上血细胞数目减少,鳃小片肿大变粗或萎缩变细,并出现明显的细胞质空泡化,黏液细胞排列松散,间隙较大(图1d);pH 10.0组中,鳜丝正常细胞数量减少,鳃小片萎缩严重,层间细胞团消融,上皮细胞大部分脱落,黏液细胞胞膜不明显,细胞质空泡化愈加明显(图1e)。

2.3 酸碱胁迫对鳜肝脏组织结构的影响

72 h后,pH 7.0组中,鳜肝细胞呈较为规则的卵圆形,排列有序,分布均匀,胞质内含物明显,细胞核多数表现为正常形态,且位置居中,肝索紧密,肝血窦清晰不规则,细胞间脂肪分布均匀(图2a);pH 4.0组中,鳜肝细胞数目明显减少,细胞膜不明显,血细胞排列无序且密集,细胞核着色深、发生变形,肝索紊乱,肝血窦扩张,细胞间脂肪呈弥散状(图2b);pH 5.5组中,鳜肝细胞肿大,松散,肝血窦出现融合现象,肝索排列较紊乱(图2c);pH 8.5组中,鳜肝细胞数目多,肿大,肝血窦伸长(图2d);pH 10.0组中,鳜肝细胞核着色较深,血细胞发生变形,细胞核呈长条状,肝血窦扩张(图2e)。

图2 酸碱胁迫72 h对鳜肝脏组织结构形态的影响Fig.2 Effect of pH stress on the liver histological structure of S. chuatsi after 72 ha.pH 7.0组(×200);b. pH 4.0组(×200);c. pH 5.5组(×200);d. pH 8.5组(×200);e.pH 10.0组(×200);H. 肝细胞;BC. 血细胞;N. 细胞核; HS. 肝血窦; FG. 细胞间脂肪; HeC.肝索.a.pH 7.0 group (×200); b. pH 4.0 group (×200); c. pH 5.5 group (×200); d. pH 8.5 group (×200); e. pH 10.0 group (×200); H. hepatocyte; BC. blood cell; N. nuclear; HS. hepatic sinusoid; FG. f-granule; HeC.hepatic cord.

2.4 酸碱胁迫对鳜鳃组织中解毒酶活性的影响

pH 7.0组,鳜鳃组织中各解毒酶的活性变化不显著(P>0.05),而其余各试验组解毒酶的活性均呈先升后降的变化趋势(图3)。酸碱胁迫后3 h,尿苷二磷酸葡醛酸转移酶与谷胱甘肽S-转移酶的活性开始升高;胁迫12 h后,pH 4.0、5.5、8.5试验组鳜鳃中尿苷二磷酸葡醛酸转移酶的活性达到最高值,随后开始降低;胁迫24 h后,黄素单加氧酶的活性达到最高值,此时pH 10.0组中细胞色素P450酶的活性和pH 5.5组中谷胱甘肽S-转移酶的活性均达到最高且显著高于其他试验组(P<0.01);胁迫至72 h后,各试验组中细胞色素P450酶和黄素单加氧酶的活性差异不大,pH 4.0、8.5、10.0组中尿苷二磷酸葡醛酸转移酶的活性低于pH 7.0组,而谷胱甘肽S-转移酶的活性显著高于pH 7.0组(P<0.05)。

图3 酸碱胁迫对鳜鳃组织中几种解毒酶活性的影响Fig.3 Effect of pH stress on activity of detoxification enzymes in gill of S. chuatsi*表示同一处理组不同时间点间差异显著(P<0.05);**表示差异极显著(P<0.01);下同.*represented significant differences within the same treatment among different times (P<0.05); **represented very significant differences(P<0.01); et sequentia.

2.5 酸碱胁迫对鳜肝组织中解毒酶活性的影响

在pH 7.0组中,肝组织中各解毒酶的活性变化不显著(P>0.05),而其余各试验组细胞色素P450酶、黄素单加氧酶的活性呈先升高后降低的变化趋势,谷胱甘肽S-转移酶的活性在72 h内呈逐渐上升的趋势,尿苷二磷酸葡醛酸转移酶活性在72 h胁迫过程中虽有所波动,但整体上呈先升后降的变化趋势(图4)。胁迫后3 h,细胞色素P450酶和尿苷二磷酸葡醛酸转移酶的活性开始升高,pH 8.5组中尿苷二磷酸葡醛酸转移酶的活性在12 h时达到峰值,随后开始下降;pH 4.0、8.5、10.0组中肝细胞色素P450酶的活性在胁迫后24 h达到最高值,至胁迫72 h活性下降;除pH 7.0组外,各试验组肝黄素单加氧酶的活性均在48 h到达峰值,随后开始下降;谷胱甘肽S-转移酶的活性在胁迫72 h后达到最高值并且显著高于pH 7.0组(P<0.05)。

图4 酸碱胁迫对鳜肝组织中几种解毒酶活性的影响Fig.4 Effect of pH stress on activity of detoxification enzymes in liver of S.chuatsi

3 讨 论

3.1 鳜酸碱耐受性

小规格鱼对环境胁迫的耐受性通常比大规格鱼弱,如体长约2 cm的异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)对盐度和碳酸盐碱的安全浓度(2.98 mol/L和13.20 mol/L)低于体长约9 cm的异育银鲫(4.63 mol/L和20.33 mol/L)[14];但是当环境胁迫达到一定极值时,不同规格的鱼在胁迫后的死亡统计情况趋于一致,如水温25～30 ℃时,体长约8 cm和16 cm的褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)在生长性能上存在差异,当水温达到32 ℃时,两种规格鱼的成活率无显著差异[15]。本试验中,在pH 4.0和pH 10.0环境下,体质量(5.3±0.7) g的小规格幼鱼平均存活时间小于1 h,体质量(30.2±5.1) g的大规格幼鱼至少存活72 h。这样的差别可能由以下原因引起:(1)不同规格的试验鱼对酸碱耐受能力不同,尚未达到可使大规格幼鱼迅速致死的酸碱极值;(2)酸碱度的改变主要是离子浓度的改变,离子胁迫和温度胁迫对鱼的致死性不同。

3.2 酸碱胁迫对鳜鳃、肝组织结构的影响

鳃主要参与鱼类呼吸的同时还参与调节机体渗透压和酸碱平衡的过程。鳃的表面积大且与外界水环境直接接触,极易受到有毒物质的侵害,进而损害机体健康[16]。环境胁迫对鳃造成的损伤主要有两种,一种是细胞死亡、脱落等直接性损伤,另一种是鳃小片变粗变大、上皮细胞增生等防御性损伤[17]。在低氧胁迫下,卵形鲳鲹(Trachinotusovatus)的鳃上皮细胞会胀大、鳃小片会脱落[18],团头鲂(Megalobramaamblycephala)的鳃小片长度会增加[19];大口黑鲈(Micropterussalmoides)在氨氮胁迫下部分鳃小片结构消失,泌氯细胞数目增加[20];花鲈(Lateolabraxmaculatus)幼鱼在高盐度环境下,鳃丝变粗并且出现断裂脱落现象[21]。本试验结果显示,酸碱胁迫导致鳜的鳃小片变形、层间细胞团厚度减少、外部上皮细胞肿大甚至脱落、正常细胞数量减少、血细胞排列紊乱和细胞质空泡化等。在pH 4.0的环境下,鳃丝毛细血管破裂、血细胞堆积现象突出明显,意味着血液运输气体的能力(即鳃的呼吸作用)受到影响,这与鳜在此pH下耗氧率低的研究结果相符[9],也和低pH下草鱼(Ctenopharyngodonidella)鳃上皮渗血导致血氧交换困难的现象相似[22]。推测这一现象与在酸性条件下水体中H+增多,鳃上皮细胞对H+的通透性较大有关,H+通过鳃进入体内,改变血液化学成分,使血球比容升高、血液黏滞性增加[23-24]。pH 10.0环境下的上皮细胞大量脱落现象突出明显,上皮细胞附近有大量离子通道存在,预示着细胞膜通透性会受到严重破坏,影响机体离子交换体系和酸碱缓冲体系,进而影响体内NH3等产物的代谢,这与盐碱胁迫对青海湖裸鲤(Gymnocyprisprzewalskiissp.przewalskii)鳃影响的研究一致[25]。综上,酸碱胁迫对鳃的影响会有一定的差别,酸胁迫对鳃的呼吸作用损坏较强,碱胁迫对鳃的离子交换作用损坏较强。

肝脏是鱼类重要的代谢和免疫器官。新陈代谢、蛋白质合成和体内有毒物质的排泄等均离不开肝脏[26]。外界有毒物质的侵入容易对肝脏造成严重损害[27]。研究表明:低盐胁迫会造成红鳍东方鲀(Takifugurubripes)肝细胞肿大膨胀[28];亚硝态氮胁迫下鳙(Aristichthysnobilis)的肝细胞核肿大且数量增多[29];草鱼和革胡子鲇(Clariasgariepinus)在亚硝态氮含量高的环境中,肝组织处空泡化严重,细胞核发生固缩[30-31];多氯联苯1242对鲤(Cyprinuscarpio)胁迫严重时,鲤会出现肝细胞膜溶解,细胞核固缩甚至丢失现象[32];亚致死浓度溴氰菊酯(杀虫剂)胁迫食蚊鱼(Gambusiaaffinis)后会导致其细胞核萎缩,组织坏死[33]。本试验中,pH 5.5与pH 8.5组中鳜肝细胞肿大,推测可能是由于酸碱胁迫激发了肝细胞的活性,位于肝细胞的相关酶类参与反应,表现为肝细胞趋于肿大[34]。pH 4.0和pH 10.0组中出现鳜肝细胞排列紊乱、细胞核变形、肝血窦扩张和细胞间脂肪堆积等现象。与其他常见离子或化学试剂胁迫结果比较发现,肝组织在结构形态方面的变化比较相近[28-33]。这表明造成胁迫压力的离子或试剂成分不同,相应代谢转运的路径不同,但肝脏在结构形态上的应答表现相似。低强度胁迫会引起肝细胞肿大或数量增多,高强度胁迫会导致细胞核变形等损伤。

3.3 酸碱胁迫对鳜鳃、肝组织中解毒相关酶活性的影响

生物可以通过多种方式抵御环境胁迫和保持体内环境稳定,其一是在各类解毒酶(生物转化酶)的作用下,将疏水性化合物转化为更易从生物体中排出的亲水性衍生物。通常,细胞色素P450酶和黄素单加氧酶等作为Ⅰ相解毒酶参与氧化、还原及水解反应,尿苷二磷酸葡醛酸转移酶和谷胱甘肽S-转移酶等作为Ⅱ相解毒酶参与结合反应[10]。长期适应高温的鱼体内细胞色素P450酶的活性比低温的鱼要高[35];四鼻须鲤肝脏中谷胱甘肽S-转移酶活性随氨氮浓度的升高而不断升高[36]。本试验中,pH 7.0组的相关解毒酶(细胞色素P450酶、黄素单加氧酶、尿苷二磷酸葡醛酸转移酶、谷胱甘肽S-转移酶)在鳃和肝组织中的活性始终无显著变化。其余各试验组中,酸碱胁迫3 h或6 h后,细胞色素P450酶、黄素单加氧酶和谷胱甘肽S-转移酶的活性均开始升高;胁迫48 h,上述解毒酶的活性显著高于pH 7.0组和初始水平(对照);72 h后细胞色素P450酶和黄素单加氧酶回落接近对照组,谷胱甘肽S-转移酶活性仍然显著高于对照组。尿苷二磷酸葡醛酸转移酶的活性在72 h内波动较大;酸碱胁迫12 h,尿苷二磷酸葡醛酸转移酶活性显著高于对照;胁迫48 h,其活性下降接近甚至显著低于对照组。这与其他解毒酶不同。上述结果表明,尽管在酸碱胁迫(pH 4.0～10.0)下鳃和组织结构会发生一定变化,但鳜仍能够启动生物体化学防御机制,提高解毒酶活性,通过生物转化将体内毒物排出体外。同时,不同酶的表达趋势也反映了其作用机制存在时间效应等方面的差异。细胞色素P450酶和黄素单加氧酶同属于Ⅰ相酶,表达趋势接近。尿苷二磷酸葡醛酸转移酶和谷胱甘肽S-转移酶虽然都是Ⅱ相酶,但表达趋势不同,尿苷二磷酸葡醛酸转移酶较早达到高峰而后下降,表明尿苷二磷酸葡醛酸转移酶主要在前期起作用。

4 结 论

pH 4.0、10.0组内小规格鳜幼鱼(5.3±0.7) g在1 h内全部死亡。酸碱胁迫(pH 4.0～10.0)会对鳜组织器官造成变化或损伤。酸胁迫引起的鳃毛细血管破裂、血细胞堆积现象突出明显,对鳃的呼吸作用损害较强。碱胁迫引起的鳃上皮细胞的大量脱落现象突出明显,对鳃的离子交换作用损害较强。肝脏在结构形态上的变化与由其他离子胁迫引起的变化相类似,低强度胁迫会引起肝细胞肿大或数量增多,高强度胁迫会导致细胞核变形等损伤。尽管组织结构发生变化,细胞色素P450酶、黄素单加氧酶、尿苷二磷酸葡醛酸转移酶、谷胱甘肽S-转移酶仍参与了鳜在酸碱胁迫下的适应过程,其作用机制存在时间和效应等方面的差异。细胞色素P450酶和黄素单加氧酶表达趋势接近,尿苷二磷酸葡醛酸转移酶和其他解毒酶相比主要在前期起作用。研究结果丰富了鳜应答和耐受酸碱胁迫的基础理论数据。