草鱼脂肪组织及脂肪细胞qRT-PCR内参基因的筛选

胡泽超,邹孝翠,孙 健,边晨晨,吉 红

( 西北农林科技大学 动物科技学院,陕西 杨凌 712100 )

实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术已成为分子生物学领域开展基因定量表达分析的重要手段[1-2]。然而,RNA质量、基因扩增效率等因素均会影响qRT-PCR结果的准确性[3-4]。因此,通常需要引入合适的内参基因对试验数据进行标准化和校正,以减少试验误差。理想情况下,内参基因应在任何条件下均具有恒定的表达水平。试验常用的内参基因有18S核糖体RNA(18S rRNA)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因、延伸因子1α(EF1α)基因、β-肌动蛋白(β-actin)基因等。研究发现,一些内参基因表现出不同程度的表达稳定差异性[5-6]。金属铬胁迫下的草鱼(Ctenopharyngodonidella)肝胰脏组织18S rRNA、GAPDH、β-actin、β微球蛋白(β2m)内参基因的稳定性研究表明,β-actin基因的表达水平与其他基因有显著差异[7]。这与嗜水气单胞菌(Aeromonasehydrophila)感染的肝脏和头肾组织18S rRNA、GAPDH、β-actin、EF1α基因稳定性研究结果类似,β-actin基因的表达极不稳定[8]。草鱼呼肠孤病毒感染后的草鱼脾组织18S rRNA、GAPDH、β-actin、EF1α基因稳定性研究显示,EF1α基因表达稳定性很差[9]。以18S rRNA基因作为内参基因,会对草鱼肌球蛋白重链基因的表达检测结果造成偏差[10]。因此,需要筛选出特定条件下稳定表达的内参基因或其组合,以保证qRT-PCR结果的准确性。而对营养干预条件下草鱼内参基因表达稳定性的研究尚未见报道。

笔者以不同脂肪水平日粮所饲养草鱼的腹腔脂肪组织及不同浓度油酸处理的草鱼脂肪细胞为试验材料,利用qRT-PCR技术并结合GeNorm[11]、NormFinder[12]、BestKeeper[13]软件对β-actin、EF1α、GAPDH、18S rRNA内参基因的表达稳定性进行评估,以筛选出稳定表达的内参基因或其组合,从而为今后在脂肪营养干预条件下的草鱼脂肪组织及脂肪细胞中基因表达分析研究提供理论基础和参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理

试验草鱼购自广州金沙水产养殖场;选取90尾体质量为(15.0±0.5) g的草鱼,随机分配,共3个试验组,每组设3个平行,每个平行10尾。试验开始前用4%脂肪含量的草鱼日粮饲喂暂养1周,使其适应新环境和饲料;暂养1周后,3个组随机分配用脂肪质量分数为4%、8%、12%的草鱼日粮饲喂,并将其饲养在室内9个1.0 m×0.5 m×0.6 m的鱼缸中;按鱼体质量的1%～3%饲喂,每日8:00、12:00、18:00投喂,养殖期间充气泵24 h充氧,保证充足溶解氧,开关室内日光灯模拟室外昼夜交替,每隔3 d更新1/3～1/2水体,饲养4周。试验期间养殖水温26.5～27.5 ℃,pH 7.5～8.5,溶解氧质量浓度>5.0 mg/L。

1.2 样品采集

饲养试验结束后,禁食24 h,再用麻醉剂间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐麻醉草鱼,采集草鱼的腹腔脂肪组织,液氮处理后-80 ℃储存备用。

1.3 脂肪细胞培养及油酸处理

自杨凌康乐市场购得体质量约1 kg健康无病草鱼6尾。麻醉后剪断鳃弓放血,用洗洁精清洗鱼体3遍至洁净后待用。草鱼前体脂肪细胞分离和培养参考实验室建立的培养体系[14]:分离出腹腔脂肪组织,用磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)对组织进行4次洗涤,在0.1% I型胶原酶(Sigma,美国)与2% BSA(Sigma,美国)中于室温下剪碎30 min。细胞悬浮液通过200 μm尼龙过滤器过滤,于2305 r/min(离心半径10 cm)下离心10 min。离心后沉淀的细胞颗粒在红细胞裂解缓冲液中室温孵育6 min,然后洗涤2次,再悬浮于由DMEM/F12培养基、10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素组成的生长培养基(GM)中。以10 g/25 cm2的密度接种在明胶预处理的24孔板中。生长7 d后,用添加10 μg/mL胰岛素、10 nmol/L三碘甲状腺原氨酸、1 μmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)的含GM的成脂培养基中诱导分化。培养基每2 d更换1次。在分化第6天,用浓度0、40、80、120 mmol/L的油酸生长培养基孵育细胞,24 h后收集细胞,于-80 ℃条件下储存备用。对照组和处理组各设置4个平行。

1.4 总RNA提取及cDNA合成

依照RNeasy®Plus Mini Kit试剂盒(QIAGEN,德国)说明书进行草鱼脂肪组织和脂肪细胞的总RNA提取。总RNA质量检测采用质量体积1.5%琼脂糖凝胶电泳法,RNA浓度和纯度则使用NanoDropTMLite (Thermo Scientific,美国)核酸浓度测定仪检测。遵循PrimeScript®RT reagent Kit With gDNA Eraser (TaKaRa, 日本)逆转录试剂盒说明书的指导将提取的RNA合成单链cDNA,再用60 μL的灭菌水稀释混匀,于-20 ℃保存,用于qRT-PCR分析。

1.5 引物设计及合成

β-actin、EF-1α、GAPDH、18S rRNA 4个候选内参基因的引物由北京擎科生物科技有限公司合成,引物序列[9]见表1。

表1 候选内参基因的引物序列Tab.1 Primer sequences for the candidate reference genes

1.6 内参基因扩增效率检验

将所合成的脂肪组织和细胞cDNA进行每份10 μL等量混合,制成2种cDNA混合液,按照5倍比例稀释6个梯度(1、1/5、1/25、1/125、1/625、1/3125),以其为模板进行qRT-PCR分析;每个稀释梯度的起始模板浓度与循环阈值间呈线性关系,根据循环阈值进行自然对数作图做线性回归分析,得出相关系数r2和回归直线斜率k,再根据E=(10-1/k-1)×100%计算扩增效率E。

1.7 qRT-PCR分析

以所制备的cDNA为模板,采用所合成的引物,对包含上、下游引物各0.6 μL(0.5 μmol/L),1.0 μL cDNA,10 μL ChamQ TM SYBR®qPCR Master Mix(诺唯赞生物科技有限公司,中国)和7.8 μL灭菌双蒸水的20 μL扩增体系利用CFX96TM实时PCR检测系统(Bio-Rad,美国)进行实时PCR扩增。PCR的扩增程序:95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s,60 ℃退火及延伸共60 s,40个循环。熔曲程序:95 ℃变性15 s,以 0.05 ℃/s 速度由60 ℃升至 95 ℃;记录荧光信号的变化。每个样品3个技术重复。

1.8 内参基因稳定性软件分析及综合评估

按照文献所介绍的方法,采用GeNorm、NormFinder、BestKeeper软件分析所获取的qRT-PCR结果[15]。简单而言,利用GeNorm和NormFinder软件分析前,需要对数据预处理,首先用每组基因的所有样品中的循环阈值减去该组基因样品中最小的循环阈值,得到差值(△Ct)并转换成相对表达量2-△Ct。GeNorm软件通过每组基因样品的相对表达量2-△Ct来计算4个候选内参基因的表达稳定值,若表达稳定值越小则该基因表达稳定性越高,相反则越差;其次,以标准化因子的配对变异值(Vn/Vn+1)来判断最适的内参基因个数,当Vn/Vn+1<0.15时,最适内参基因数是n个,当Vn/Vn+1>0.15时,则最适内参基因数是n+1个。NormFinder软件利用2-△Ct值来得到表达稳定值,其表达稳定值越小表明稳定性越高,反之越低。而BestKeeper软件则是直接利用qRT-PCR检测的结果循环阈值来计算标准偏差和变异系数,并将其作为评估标准,且以标准偏差为第一标准。当标准偏差和变异系数越小,内参基因表达稳定性越好,反之越差;而当标准偏差>1时,则该内参基因表达极不稳定。最后根据GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件的分析结果,对内参基因表达稳定性进行综合排名,综合排名是根据候选内参基因在各个软件中的表达稳定性排序给予得分(第1得4分,第2得3分,以此类推),计算总分,根据总分由高到低进行综合排名,以此筛选出稳定表达的内参基因或组合。

2 结果与分析

2.1 基因扩增效率分析

4个候选内参基因qRT-PCR扩增效率分析结果见表1,以梯度稀释的cDNA为模板制作标准曲线计算扩增效率,结果表明,4个内参基因的扩增效率均为95%～105%,符合qRT-PCR对扩增效率的要求,且相关系数r2均接近1,具有高线性拟合度,结果可靠,可进行后续的研究分析。

2.2 候选内参基因表达稳定性分析

2.2.1 GeNorm软件分析

候选内参基因表达稳定性GeNorm分析结果见图1和图2。结果显示,在脂肪组织中,4个候选内参基因的表达稳定值排序为:18S rRNA=EF1α

图1 候选内参基因GeNorm分析稳定值排序Fig.1 Stability value ranking in GeNorm of candidate reference genesa.脂肪组织;b.脂肪细胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

图2 GeNorm分析最适内参基因数目Fig.2 Analysis of the optimal number of reference genes by GeNorma.脂肪组织;b.脂肪细胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

2.2.2 NormFinder软件分析

候选内参基因表达稳定性NormFinder分析结果见图3,结果显示,在脂肪组织中,4个候选内参基因的表达稳定值排序为:18S rRNA<β-actin

图3 候选内参基因Normfinder分析的稳定值排序Fig.3 Stability value ranking in Normfinder of candidate reference genesa.脂肪组织;b.脂肪细胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

2.2.3 BestKeeper软件分析

候选内参基因表达稳定性BestKeeper分析结果见表2和图4。结果显示,在脂肪组织中,4个候选内参基因表达标准偏差排序为:β-actin<18S rRNA

图4 候选内参基因Bestkeeper分析的稳定性排序Fig.4 Stability ranking in Bestkeeper of candidate reference genesa.脂肪组织;b.脂肪细胞.a.adipose tissue; b.adipocytes.

表2 候选内参基因Bestkeeper软件的稳定性分析Tab.2 Stability analysis of candidate reference genes by Bestkeeper software

2.2.4 候选内参基因综合分析及排序

一般认为,结合多种算法的分析结果而筛选出来的稳定内参基因或组合可以达到准确校正数据结果的目的。综合3种算法得出的结果见表3。在脂肪组织中,4个候选内参基因表达稳定性的综合排名为:18S rRNA>β-actin>GAPDH>EF1α,18S rRNA基因是表达稳定性最佳的内参基因;在脂肪细胞中,4个候选内参基因表达稳定性的综合排名为:18S rRNA=β-actin>GAPDH>EF1α,18S rRNA、β-actin基因是表达稳定性最佳的内参基因;另外,GeNorm的标准化因子配对差异分析结果均显示,最适内参基因数至少是2个,所以选取表达稳定性靠前的18S rRNA、β-actin基因作为最佳内参基因组合(表3)。

表3 候选内参基因综合分析及排序Tab.3 Comprehensive analysis and sequencing of candidate reference genes

3 讨 论

qRT-PCR技术是基因表达分析的常规手段。研究表明, 内参基因的表达稳定性会随试验条件的变化而产生差异性[9,16]。因此,筛选在具体试验条件下理想的内参基因的研究至关重要。

3.1 18S rRNA内参基因的表达稳定性分析

目前,有关鱼类内参基因表达稳定性的研究结果不尽相同。在大西洋鲑(Salmosalar)[17]、斑马鱼(Daniorerio)[18]和黄鳝(Monopterusalbus)[19]中,不同组织间最为稳定表达的内参基因为EF1α;而在青鳉(Oryziaslatipes)[20]、草鱼[9]和泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)[21]中,不同组织间稳定表达的内参基因是18S rRNA。18S rRNA在机体各组织中表达量都很高,是由最为保守的基因之一18S rDNA转录而来,故18S rRNA基因通常都能稳定存在,受因素调控较小,是一种常用的内参基因[22]。本试验显示,18S rRNA基因是脂肪组织及脂肪细胞中表达稳定性最高的内参基因。在褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)不同发育阶段及低温处理的胚胎中发现,18S rRNA基因较β-actin、GAPDH及EF1α 3个基因更适合作为内参基因[23]。这样的现象也在草鱼的9个组织及在草鱼呼肠孤病毒感染后的不同时间点的草鱼脾组织中均有发现,18S rRNA基因同样稳定表达[9]。在重金属镉胁迫下的草鱼肝胰脏的相关研究中再一次被证明,18S rRNA基因在所选内参基因中拥有最高的表达稳定性[7]。这些研究结果与本试验类似,均显示18S rRNA基因在各自的试验条件下稳定表达;有研究表明,rRNA合成的调控与mRNA无关,并在影响mRNA表达的各种条件下,rRNA的表达几乎没有变化,在各种试验条件下均相对稳定[24]。所以可以推测,18S rRNA基因的表达在本试验涉及的脂肪营养条件下不易被干预,至少其优于其他3种候选内参基因。但在采用18S rRNA基因作为草鱼肌球蛋白重链基因mRNA 在发育阶段的内参基因时,其表达量呈不稳定状态[10];并且一些研究证实,核糖体RNA确实会受到某些药物和生物因素的影响[25]。所以将18S rRNA基因作为理想内参基因不能成为普适性规律。总之,18S rRNA基因在本试验条件下可作为一种理想的内参基因。

3.2 β-actin内参基因的表达稳定性分析

β-actin在维持细胞生理活动方面如细胞结构、运动、分裂等都发挥着十分重要的作用,是一种编码肌动蛋白的高度保守基因,是微丝的结构成分,也是细胞骨架的主要成分[22]。因表达稳定,已被广泛应用于qRT-PCR研究中,正如PubMed搜索结果所示,超过50%的qRT-PCR研究是使用β-actin基因作为参考基因[25]。本试验结果显示,β-actin基因在草鱼脂肪组织中的表达稳定性仅次于18S rRNA基因,而在脂肪细胞中同18S rRNA基因一样也能稳定表达。与本试验选择一致的候选内参基因(18S rRNA、β-actin、EF1a、GAPDH)的研究发现,在草鱼的9个组织及被草鱼呼肠孤病毒感染的CIK细胞中,β-actin基因表达稳定性均较差,而在草鱼呼肠孤病毒感染后不同时间点的脾组织中β-actin基因表达稳定性仅次于18S rRNA基因[9]。而关于罗非鱼(Oreochromis)[26]、异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)[27]、斑马鱼[28]等的研究显示,β-actin基因分别在繁殖、病毒感染和细菌感染等特定条件下是最稳定的内参基因。然而,越来越多的证据表明,β-actin基因在某些情况下有表达差异,其表达会受生长、分化,甚至一些生物刺激的影响[29]。笔者设计的不同脂肪营养水平处理会导致脂代谢差异,组织及细胞的生长和营养水平密切相关,理论上β-actin基因的表达水平存在差异性,本试验结果显示,脂肪组织的β-actin基因表达稳定性虽不是最佳,但其稳定性接近18S rRNA基因。脂肪细胞β-actin和18S rRNA基因表达稳定性一致,这可能与脂代谢复杂的调控过程有关,β-actin可能较小程度受到脂肪代谢的调节。所以,最终建议将两者结合作为基因表达分析中的双内参,这样可以避免单一内参基因校正的局限性(如内参基因与目的基因的扩增效率差异等),还能使试验结果更加准确。

3.3 GAPDH内参基因的表达稳定性分析

GAPDH也是较常见的管家基因之一,常被用于基因表达数据的标准化,在DNA复制、细胞外分泌和细胞骨骼结构研究方面至关重要[30]。本试验结果显示,GAPDH基因表达稳定性相对弱于18S rRNA和β-actin基因。Su等[9]在对草鱼的鳃、头肾、心脏、肠道、肝脏、肌肉、皮肤、脾脏和体肾等9个不同组织及用草鱼呼肠弧病毒感染了不同时间的脾组织进行内参基因筛选的研究中发现,GAPDH基因在所选4个内参基因中的表达稳定性均排名第3,稳定性相对较差,这和本试验有着相似的研究结果。有研究显示,GAPDH易受到试验条件的影响,并因为它是糖酵解和糖异生过程中的关键酶,容易不稳定[31]。因此,GAPDH基因作为内参基因也存在一定的争议。而本试验涉及不同脂肪含量饲料投喂,不同脂肪量摄入的试验组脂肪代谢存在差异,结合脂肪代谢与糖代谢的紧密联系,可预见GAPDH基因表达存在差异。因此,GAPDH基因不适合作为本试验条件下的理想内参基因。

3.4 EF1α内参基因的表达稳定性分析

延伸因子1α(EF1α)参与了mRNA的翻译,是细胞中表达比较多的蛋白质之一[32]。本试验结果表明,EF1α在脂肪组织及细胞中表达稳定性最差,不及其他3个内参基因。这与草鱼呼肠孤病毒感染草鱼脾组织的研究具有相似的结果,EF1α基因在4个内参基因中表达稳定性最差[9]。在鲤疱疹病毒Ⅱ型感染不同时间的脾脏中,EF1α基因稳定性最佳[27],在达氏鲟(Acipenserdabryanus)[33]、蓝点马鲛(Scomberomorusniphonius)[34]的相关研究中均出现与之类似的研究结果。有研究表明,EF1α在生物的新陈代谢过程中发挥着非常重要的作用,是蛋白质合成过程的关键因子[35]。在本试验的不同脂肪营养干预条件下,试验组脂代谢存在差异,结合蛋白质代谢与脂代谢的紧密联系,可预见EF1α表达存在差异,说明该基因可能在脂代谢过程中发挥调节作用。所以,EF1α基因不适合作为草鱼脂肪组织和脂肪细胞的理想内参基因。

以上结果表明,造成与本试验中脂肪组织和脂肪细胞的稳定内参基因种类异同性的因素可能一方面是样品种类特性,另一方面是所选内参基因数量和种类,但更多还是取决于试验处理条件。研究再次证明,基本上不存在具备普遍稳定表达特性的内参基因,一般而言,内参基因均会受到不同因素的干扰。因此,在开展qRT-PCR试验前,需要筛选合适的内参基因,以确保研究结果的准确性。虽然在很多研究中都能筛选出稳定表达的内参基因,但是也存在筛选失败的情况,如被细菌感染后,条石鲷(Oplegnathusfasciatus)[36]、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[37]等都未能筛选出在所有组织中均能稳定表达的内参基因。

4 结 论

本试验条件下,在草鱼脂肪组织和脂肪细胞中稳定表达的内参基因是18S rRNA基因,而β-actin基因在脂肪细胞中与18S rRNA基因表达稳定性一致。考虑到研究工作的复杂性、成本以及单一内参校正的局限性,结合本试验结果,建议选择18S rRNA、β-actin基因作为草鱼脂肪组织和脂肪细胞的内参基因组合。