混合分散固相萃取联合柱前衍生高效液相色谱法测定蜂蜜中草甘膦残留

郭新颖，谢超

（南通市疾病预防控制中心，江苏 南通 226001）

草甘膦，化学名称为N-磷酸甲基甘氨酸，化学式为C3H8NO5P，是农田庄园道路中广泛使用的一种内吸传导型广谱灭生性除草剂，也是农药孟山都农达的一种有效活性成分[1‒2]。由于草甘膦稳定性好、极性强、除草效率高，极易溶于水，美国于20世纪70年代中期批准其用于农作物。当草甘膦渗入土壤后会与金属离子结合而失活，继而在环境和生物体内不断富集，通过环境介质和食品进入人体，对身体健康构成不可逆威胁[3‒4]。2017 年10 月27 日，世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)公布的致癌物清单中，将草甘膦列入2 A类致癌物清单，目前草甘膦的精准检测及其所引发的健康风险问题已成为国内外学者的研究热点[5‒6]。蜂蜜制品因其具有丰富的营养成分和活性功能而成为消费者青睐的绿色天然食品，作为重要出口支柱产业，我国蜂蜜产业正处于转型升级的特殊时期，由于生产技术水平较低、行业标准存在缺陷、市场环境不规范等原因，我国蜂蜜产业正面临国际绿色贸易壁垒的风险。蜂蜜中草甘膦检出和超标事件频频爆出和持续发酵[7‒8]，警示着严格规范蜂蜜中草甘膦检测方法与行业标准势在必行。目前，草甘膦的测定方法主要有离子色谱法[9‒10]、酶联免疫法[11‒12]、高效液相色谱法[13‒15]和液相色谱-质谱法[16‒19]等。离子色谱定性能力较差，需要与其它具有定性能力的分析技术联用；酶联免疫检测技术主要用于辅助现场检验诊断，定量检测的特异性和灵敏性有待提高；质谱方法需要昂贵的仪器，难以普遍推广。液相色谱法和液相色谱-质谱法的样品处理常常采用固相萃取小柱净化、二氯甲烷等毒性有机溶剂液液萃取和试剂衍生化等进行联合操作，流程繁琐复杂，有机试剂耗费较多，而且过柱和旋转蒸发流程需要专业操作才能保证提取效率，耗时费力。笔者采用纯水提取蜂蜜中草甘膦，用多壁碳纳米管(MWCNTs)和十八烷基硅烷键合硅胶(C18)材料进行混合分散固相萃取净化，经过高效的试剂衍生化，采用高效液相色谱荧光检测器进行定量测定。该方法样品处理操作简单快速，回收率高，精密度好，分离能力强，速度快，能够满足蜂蜜中草甘膦农药残留的定量测定。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260 型，美国安捷伦科技有限公司。

超声波清洗器：HN10-300D 型，中国上海汉诺仪器有限公司。

高速冷冻离心机：Primo B 型，美国赛默飞科技有限公司。

高纯水发生器：Milli-Q 型，德国默克密理博实验室设备有限公司。

草甘膦标准品：质量分数不小于99%，上海安谱实验科技公司。

电子天平：AG245 型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒(上海)有限公司。

十八烷基硅烷键合硅胶(C18)：粉末状，粒径为40 μm，孔径为60 Å，上海安谱实验科技公司。

9-芴甲基氯甲酸酯：质量分数不小于98%，上海源叶生物科技有限公司。

多壁碳纳米管(MWCNTs)：国药集团化学试剂有限公司。

四硼酸钠：分析纯，西格玛试剂公司。

乙腈：色谱纯，德国默克公司。

蜂蜜样品：瓶装，市售。

1.2 样品处理

准确称取2.0 g 蜂蜜样品于试管中，加入10 mL水充分溶解，室温震荡超声提取30 min，以4 000 r/min离心10 min，取上清液。移取2 mL提取液先经MWCNTs和C18混合分散固相吸附剂吸附净化，然后加入0.05 mol/L 四硼酸钠溶液0.5 mL 和1.0 mg/mL 9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液1.0 mL 充分混匀振摇，于室温下反应1 h进行试剂衍生，衍生液经0.45 μm滤膜过滤后，经色谱柱分离，采用荧光检测器检测。

1.3 仪器工作条件

色谱柱：ZORBAX 柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；流动相：A 相为乙腈，B相为0.30 g/L 磷酸二氢钾溶液(pH 2.0)，流量为1.5 mL/min；柱温：30 ℃；进样体积：20 μL；激发波长：254 nm；发射波长：315 nm。

1.4 溶液配制

准确称取草甘膦标准物质50.5 mg (精确至0.1 mg)，用水稀释并定容于50 mL 容量瓶中，得到1 000 μg/mL 草甘膦标准储备液。分别移取适量的草甘膦标准储备液，用水稀释定容，配制成质量浓度依次为0.005、0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/mL的草甘膦系列标准工作溶液。

1.5 测定方法

分别取草甘膦系列标准工作溶液20 μL注入高效液相色谱仪中，在1.3仪器工作条件下测定，以标准工作溶液的质量浓度为横坐标，以标准工作溶液的色谱峰面积为纵坐标进行线性拟合，样品中的草甘膦采用外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 提取剂选择

草甘膦属于强极性分子，极易溶于水，几乎不溶于有机溶剂，因此样品处理中不宜采用有机溶剂作为提取液，综合考虑提取效果和提取成本，直接选择水作为样品提取剂。

2.2 衍生条件选择

2.2.1 衍生试剂浓度

分别选择0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 mg/mL 的9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液对蜂蜜样品中的草甘膦进行衍生，考察不同质量浓度的衍生试剂对草甘膦回收率的影响，结果见表1。由表1 可知，当衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液的质量浓度小于1.0 mg/mL时，草甘膦的回收率偏低，说明衍生试剂的质量浓度较低时衍生效果较差，而当衍生试剂的质量浓度大于或等于1.0 mg/mL时，草甘膦的回收率较高，表明衍生效果较好。综合考虑，选择衍生试剂9-芴甲基氯甲酸酯乙腈溶液质量浓度为1.0 mg/mL。

表1 不同质量浓度衍生试剂时草甘膦的回收率

2.2.2 衍生时间

在室温条件下，分别选择衍生时间为0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 h 进行试验，比较样品中草甘膦的回收率，结果见表2。由表2 可知，当衍生时间大于或等于1 h时，草甘膦的回收率较高，而当衍生时间小于1 h 时，草甘膦的回收率较低，说明适当延长衍生时间有利于衍生反应完全，衍生效果较好。考虑到检测效率，最终选择衍生时间为1.0 h。

表2 不同衍生时间时草甘膦的回收率

2.2.3 衍生温度

分别选择在室温25 ℃、水浴30、35、40、50、60 ℃条件下进行试验，比较草甘膦回收率，结果见3。由表3可知，当温度不高于30 ℃时，草甘膦的回收率较高，衍生效果较好；当温度高于30 ℃时，草甘膦的回收率较低，衍生效率降低，说明高温不利于目标组分草甘膦与衍生试剂的衍生反应，考虑到在常温条件下即可满足试验需要，因此最终将反应温度设定为室温25 ℃。

表3 不同衍生温度时草甘膦的回收率

2.3 固相萃取剂用量

MWCNTs和C18混合固相萃取剂用量对草甘膦的萃取效果产生直接影响。在2 mL 加标蜂蜜样品提取液中，分别加入不同质量的MWCNTs和C18，漩涡混匀离心后测定，结果见表4。由表4 可知，加标样品提取液经不同用量的MWCNTs 和C18萃取，均能够检测到草甘膦，当萃取剂的用量为60 mg MWCNTs和120 mg C18时，草甘膦的回收率最高，表明萃取效果最好，所以最终采用混合固相萃取剂用量为60 mg MWCNTs和120 mg C18。

表4 MWCNTs和C18不同用量时草甘膦的回收率

2.4 色谱条件选择

参考国家标准[20‒21]选择色谱条件，优化结果见1.3。

2.5 色谱图

在1.3 仪器工作条件下，分别测定质量浓度为0.02 μg/mL 的草甘膦标准溶液、阴性样品溶液和加标样品溶液，色谱图如图1所示。由图1可以看出，在选定的色谱条件下，草甘膦色谱峰形良好，可用于定量分析。

图1 草甘膦标准溶液、空白样品溶液和加标样品溶液色谱图

2.6 线性方程与检出限

在1.3仪器工作条件下，由低浓度到高浓度依次进样测定草甘膦系列标准工作溶液，以草甘膦质量浓度为横坐标，以对应色谱峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线，计算得草甘膦的标准工作曲线方程为y=1 016.494 5x+5.801 1，相关系数为0.999 9，质量浓度线性范围为0.005～5.00 μg/mL。表明该方法线性良好，满足测定要求。

取质量浓度为0.5 μg/mL 的草甘膦标准溶液，用水逐级稀释，在1.3仪器工作条件下进行测定，将信噪比(S/N)为3∶1时对应的草甘膦的质量浓度换算为样品中草甘膦的质量分数，作为方法检出限，得检出限为0.025 mg/kg。

2.7 加标回收与精密度试验

在蜂蜜样品中分别添加0.02、0.1、0.25 μg/mL三种质量浓度水平的草甘膦标准溶液，按照本试验的样品处理方法提取净化后进行测定，每个样品平行测定6 次，结果见表5。由表5 可知，草甘膦的平均加标回收率为78.1%～92.3%，测定结果的相对标准偏差为2.8%～8.4%，表明该方法的精密度、准确度均较高，满足样品的测定要求。

表5 加标回收与精密度试验结果

3 结语

以MWCNTs和C18作为混合分散固相萃取吸附剂联合高效液相色谱荧光检测技术，建立了一种定量测定蜂蜜中强极性农药草甘膦残留的分析方法。两种吸附剂联合用于处理样品可获得良好的净化效果。该方法操作简单、快速高效、绿色环保、省时省力、定量准确，可作为一种蜂蜜中草甘膦农药残留检测新方法。