蕨麻单宁的分离纯化及抗氧化活性研究

曲俊儒 李军乔 田甜 王鑫慈 吕博文

摘要 采用大孔吸附树脂法和有机溶剂萃取法对蕨麻块根中单宁成分进行分离纯化，并考察不同纯化方法下得到单宁样品对DPPH·和·OH的清除能力。结果表明，大孔树脂纯化蕨麻单宁的最佳工艺条件：选用X-5型大孔树脂，上样流速为1.0 mL/min，上样液浓度为1.01 mg/mL，洗脱液为60%乙醇溶液，洗脱流速为1.5 mL/min。乙酸乙酯萃取物、乙酸乙酯萃余物、大孔树脂纯化物、乙酸乙酯萃取经大孔树脂纯化物和乙酸乙酯萃余经大孔树脂纯化物的纯度分别为36.65%、34.87%、59.72%、81.09%、80.43%。在样品浓度为0.05 mg/mL时，粗提液和上述样品对DPPH·的清除率分别为77.50%、93.01%、82.03%、88.63%、74.21%、79.52%；在样品浓度为0.50 mg/mL时，粗提液和上述样品对· OH的清除率分别为72.09%、60.88%、64.78%、76.55%、58.38%、67.94%。

关键词 蕨麻；单宁；分离纯化；抗氧化活性；大孔吸附树脂

中图分类号 R 284  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）12-0142-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.033

Study on Isolation，Purification and Antioxidant Activities of Tannins of Potentilla anserina

QU Jun-ru1，2，3， LI Jun-qiao1，2，3，TIAN Tian1，2，3 et al

（1.College of Ecological Environment and Resources， Qinghai Nationalities University，Xining，Qinghai 810007;2.Qinghai Plateau Crop Germplasm Resources Research and Utilization Laboratory，Xining，Qinghai 810007;3.Key Laboratory of High-value Utilization of Characteristic Economic Plants， Qinghai Province，Xining，Qinghai 810007）

Abstract The macroporous adsorption resin method and organic solvent extraction method were used to separate and purify the tannin components from root tuber of Potentilla anserina， and the scavenging ability of tannin samples obtained under different purification methods for DPPH· and·OH was investigated.The result showed that the optimal process conditions for purifying the tannin from root tuber of Potentilla anserina with macroporous resin： select X-5 macroporous resin， the flow rate of sample was 1.0 mL/min， the feed concentration of sample was 1.01 mg/mL， the desorption solvent was 60% ethanol solution， and the flow rate was 1.5 mL/min.The purity of ethyl acetate extract， ethyl acetate residue， macroporous resin purification， ethyl acetate extract purified by macroporous resin， and ethyl acetate residue purified by macroporous resin were 36.65%， 34.87%， 59.72%， 81.09% and 80.43%， respectively.At a sample concentration of 0.05 mg/mL， the scavenging rates of the crude extract and the above samples for DPPH· were 77.50%， 93.01%， 82.03%， 88.63%， 74.21% and 79.52%， respectively;at a sample concentration of 0.50 mg/mL， the scavenging rates of crude extract and the above samples for·OH were 72.09%， 60.88%， 64.78%， 76.55%， 58.38% and 67.94%， respectively.

Key words Potentilla anserina;Tannins;Isolation and purification;Antioxidant activity;Macroporous resin

基金項目

青海省自然科学基金计划-创新团队项目（2022-ZJ-902）；青海民族大学研究生创新项目（54M2021004）。

作者简介 曲俊儒（1997—），女，辽宁沈阳人，硕士研究生，研究方向：植物资源开发与利用。*通信作者，教授，博士，博士生导师，从事植物资源开发与利用研究。

收稿日期 2022-12-18

蕨麻（Potentilla anserina L.）为鹅绒委陵菜的变种，属蔷薇科（Rosacrae）委陵菜属（Potentilla），广泛分布于我国青海、西藏等高海拔地区，其块根中富含多种活性成分，具有广阔的科研前景。蕨麻块根中分离得到的野蔷薇苷、刺梨苷等单体成分，已证实具有较好的抗疲劳和抗缺氧作用［1-2］。单宁多存在于植物的茎、叶、表皮、果实等组织中，一般分为缩合单宁和水解单宁两大类［3］，是一种分子量为500～3 000 Da的多元酚类次生代谢物［4］。单宁类化合物具有多种药理作用，如抗菌、抗氧化、抗过敏、抗炎、抗癌、抗哮喘、免疫调节等［5-7］，还可以阻碍单纯疱疹病毒（HSV）和艾滋病毒（HIV）对营养物质的吸收和细胞病变［4，8］。其中没食子单宁和鞣花单宁可作口服剂用于抑制艾滋病（AIDS），效果优于合成的AIDS药物［9-10］;鞣花酸单宁和部分原花青素还可以作为逆转录酶抑制剂，抑制乙型肝炎病毒感染细胞中E抗原的分泌［11］。此外，单宁类化合物还被广泛应用于食品添加剂、胶黏剂、皮革、动物饲料等行业；因其独特口感在葡萄酒、茶、咖啡等饮料产品的研发中也有着不可替代的作用［12］。

目前，蕨麻中活性成分（总黄酮、总生物碱、多糖、皂苷）和营养成分（淀粉、粗蛋白、氨基酸、粗纤维、维生素、矿质元素）等方面的研究均已较为完善，对其中单宁成分的研究仍较少，尚未进行分离纯化等相关工作［13-23］。常见的单宁纯化方法有大孔吸附树脂法、膜分离法、萃取分离法、色谱法等，其中大孔树脂法因其成本低、耗能小、操作简单等优点被大量应用于工业生产中［24-27］。因此，该试验采用大孔吸附树脂纯化法、乙酸乙酯萃取分离法及二者联用方法对蕨麻块根中单宁成分进行分离提纯，并考察不同纯化方法得到单宁的抗氧化活性，建立高效简便的蕨麻单宁纯化工艺流程，为后续进一步研究提供试验基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 試材与试剂。蕨麻块根，2021年9月采自青海省西宁市湟源县蕨麻种植基地；钨酸钠；钼酸钠；磷酸；盐酸；硫酸锂；无水碳酸钠，分析纯，天津市大茂化学试剂厂；单宁酸标准品；1，1-二苯基-2-三硝基苯（DPPH）；抗坏血酸，上海源叶生物科技有限公司；X-5、D101、HP-20、HPD-400、S-8、HPD-826型大孔树脂，北京索莱宝科技有限公司。

1.1.2 仪器。UV-5500型紫外-可见光分光光度计，上海元析仪器有限公司；Neofuge23Ｒ台式高速冷冻离心机，上海力申科学仪器有限公司；BT102S微型蠕动泵，保定雷弗流体科技有限公司；SHT-40A超声波清洗器，深圳市深华泰超声清洗设备有限公司；HZQ-X160恒温震荡培养箱，苏州培英实验设备有限公司；RE101-Pro旋转蒸发仪，大龙兴创试验仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 蕨麻块根单宁提取。

1.2.1.1 脱脂蕨麻粉末的制备。

取新鲜青海蕨麻3号块根于恒温干燥箱中60 ℃烘干至恒重，粉碎过筛（60目），称取适量干燥蕨麻粉末置石油醚（1∶4）中常温浸泡48 h，待粉末脱脂后减压回收石油醚，得到蕨麻供试粉末，干燥密封保存备用。

1.2.1.2 蕨麻粗提液的制备。

精密称取已预处理的蕨麻供试粉末，加入50%乙醇溶液（1∶20），于超声功率800 W、温度60 ℃条件下提取90 min，过滤，得到蕨麻块根粗提液，保存备用［28-30］。

1.2.2 单宁的定性及定量分析。

1.2.2.1 定性分析。

取适量粗提液和单宁酸标准液分别进行单宁的FeCl3颜色反应、明胶沉淀反应和甲醛-盐酸共沸沉淀反应，对蕨麻块根粗提液中单宁成分进行初步定性分析。

1.2.2.2 定量分析。

精密称取10.20 mg单宁酸标准品于500 mL 容量瓶中，依次吸取5、10、15、20、25、30 mL于50 mL容量瓶中定容，得到0.002 04、0.004 08、0.006 12、0.008 16、0.010 20、0.012 24 mg/mL系列浓度的单宁酸溶液，采用钨酸钠-钼酸钠法［27］显色，于最大吸收波长处测定系列标准溶液吸光度。以单宁酸标准溶液浓度（mg/mL）为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线。取定量粗提液稀释后依上述方法显色测定吸光度，根据线性方程及公式（1）［31］计算单宁得率（W）。

W=V×c×V1M×V2×103×100%（1）

式中，V为稀释用容量瓶的体积（mL）；c为单宁含量（mg/mL）；V1为提取液总体积（mL）；V2为稀释液体积（mL）；M为蕨麻块根供试粉末的质量（g）。

1.2.3 蕨麻单宁的分离与纯化。

1.2.3.1 大孔树脂的静态筛选。

称取已预处理的D101、X-5、S-8、HP-20、HPD-400、HPD-826型树脂各2 g，分别装入150 mL锥形瓶中，然后加入40 mL质量浓度为0.81 mg/mL单宁粗提液，置于摇床中（30 ℃、110 r/min），振荡吸附24 h后抽滤，适量蒸馏水清洗2次，然后用60%乙醇40 mL对树脂进行振荡解吸，分别测定滤液及解吸液中单宁含量。按照公式（2）～（4）分别计算大孔树脂的吸附率、吸附量及解吸率。

1.2.3.2 洗脱剂浓度对树脂静态解吸的影响。称取已预处理的X-5型大孔树脂2 g（共6份），装入150 mL锥形瓶中，加入40 mL质量浓度为0.81 mg/mL单宁粗提液，置于摇床中（30 ℃、110 r/min），振荡吸附24 h后抽滤，适量蒸馏水清洗2次，然后用40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇40 mL对树脂进行振荡解吸，分别测定滤液及解吸液中单宁的含量，计算不同溶液浓度下树脂的解吸率。

1.2.3.3 X-5型树脂为填料的蕨麻单宁的分离工艺考察。

称取10 g已预处理的X-5型大孔树脂湿法装入层析柱（Φ 1.5 cm×30.0 cm）中，充分平衡后上样（1.01 mg/mL，100 mL），以恒流泵控制上样速度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，动态吸附后测定流出液中单宁含量。保持上样流速1.0 mL/min、上样体积100 mL，改变上样质量浓度分别为0.41、0.63、0.81、1.01、1.13、1.33、1.51 mg/mL，动态吸附后测定流出液中单宁含量。再以流速1.0 mL/min、体积100 mL和质量浓度1.01 mg/mL上样，吸附完成后使用50 mL蒸馏水冲洗柱子，再改变洗脱流速分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/min，洗脱液体积均为100 mL，测定洗脱液中单宁含量。

1.2.3.4 溶剂萃取法分离纯化蕨麻单宁。

取100 mL蕨麻粗提液于40 ℃减压干燥，粗提物用10 mL 50%乙醇溶液溶解后加入无水乙醇40 mL，充分混合后室温静置24 h后离心（4 200 r/min，10 min），于40 ℃下回收乙醇，得到除去多糖蛋白质等杂质的单宁浓缩液。再继续用等体积的石油醚和氯仿分别萃取3次，收集水相，减压浓缩，得到除去脂类及色素等杂质的单宁样品。最后，加入适量蒸馏水溶解得到的单宁样品，用等体积的乙酸乙酯萃取6次，收集萃取相和萃余相，减压浓缩，分别保存为乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃余物。

1.2.3.5 有机溶剂萃取-大孔树脂吸附联用法分离纯化蕨麻单宁。取“1.2.3.4”中所得的乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃余物作为上样液，取已预处理的X-5型大孔树脂10 g湿法装入层析柱（Φ 1.5 cm×30.0 cm）；分别精密称取蕨麻单宁乙酸乙酯萃取样品和乙酸乙酯萃余样品0.276和0.290 g，加入100 mL 50%乙醇溶液溶解；另取60%乙醇溶液100 mL作为洗脱液，保持上样流速为1.0 mg/mL、洗脱流速为1.5 mg/mL，对蕨麻单宁样品进行二次分离纯化，得到萃余经大孔树脂纯化物和萃取经大孔树脂纯化物。

1.2.3.6 验证纯化效果试验。

依上述试验条件，通过多种纯化方法分别得到不同蕨麻单宁样品，测定其中单宁含量，每组重复3次，使用旋转蒸发仪和恒温干燥箱对其进行减压浓缩并烘干至恒重，称重，计算样品中单宁的纯度：纯度=纯化样品中单宁含量（mg）/纯化样品总质量（mg）×100%。

1.2.4 蕨麻单宁抗氧化活性测定。

依据文献［28］方法，分别配制0.01～0.05和0.10～0.50 mg/mL系列浓度的不同样品溶液，与抗坏血酸进行比较，分别测定各溶液对DPPH·和·OH的清除作用。

2 结果与分析

2.1 单宁的定性与定量分析

2.1.1 定性分析。

分别于单宁酸溶液和蕨麻粗提液中加入1%明胶溶液后，二者均出现了白色絮状物；于粗提液中加入0.3% FeCl3溶液，试管中溶液变为蓝黑色；加入40%甲醛溶液与2 mL濃硫酸沸水浴反应后出现红褐色沉淀。以上定性试验均出现单宁显色反应，初步确定粗提液中含单宁类成分，且大部分为水解单宁。

2.1.2 定量分析。

分别对单宁酸标准液和蕨麻粗提液进行显色反应后，用紫外-可见光分光光度计于650～850 nm处扫描，二者均于760 nm处存在最大吸收，因此确定设定波长为760 nm 进行后续溶液吸光度测定。以吸光度（A）和单宁酸标准液浓度（c）绘制标准曲线，得到回归方程A=0.086 5c-0.010 5（R2=0.995 2）。由此得到蕨麻块根中单宁含量为2.73%。

2.2 蕨麻单宁分离纯化工艺

2.2.1 大孔树脂的静态筛选。

以各型号大孔树脂的吸附率、解吸率及吸附量为评价指标，筛选试验树脂类型，结果如表1所示。在相同试验条件下，X-5型大孔树脂对蕨麻块根单宁的静态吸附效果最好，吸附率为83.64%，解吸率为90.36%；其中HPD-826型大孔树脂对蕨麻单宁吸附率最高，达到84.95%，但解吸率较差，为84.49%；而HP-20型大孔树脂解吸率（91.72%）略高于X-5型大孔树脂，其吸附率（70.49%）却远低于X-5型大孔树脂。综合多种指标考虑，选择X-5型大孔树脂用于后续蕨麻块根单宁纯化试验。

2.2.2 洗脱剂浓度对树脂静态解吸的影响。

以不同浓度乙醇溶液作为洗脱剂，研究其质量分数对树脂解吸率的影响（图1）。一般来说，大孔树脂的色谱行为具有反向的性质，而单宁类物质易与大孔树脂之间产生氢键作用，单用水作洗脱剂效果不好，需要水与乙醇以合适配比与树脂进行交换，才能更好地将单宁物质洗脱下来［3］。由图1可知，随着洗脱剂中乙醇浓度的上升，X-5型树脂的解吸率逐步上升，于乙醇浓度60%时达到峰值，当乙醇浓度大于60%时，开始逐步下降，但高浓度乙醇溶液的洗脱能力均高于低浓度乙醇溶液，故选择60%乙醇溶液作为最佳洗脱剂。

2.2.3 以X-5型树脂为填料的蕨麻单宁的分离工艺考察。

2.2.3.1 不同流速对单宁吸附及解吸的影响。

上样和洗脱流速均会对树脂的吸附率和解吸率造成影响。一般认为，上样流速过大使得物质与树脂的交换时间较短，来不及被吸附就已流出树脂柱［31］，从而导致吸附量降低，该试验结果（图2）与之相符；随着上样流速的增大，树脂的吸附率逐渐降低，当上样流速大于1.0 mL/min时，树脂的吸附率急剧下降。同样，过快的洗脱液流速也会对树脂的解吸率造成影响，由图2可知，当洗脱流速小于1.5 mL/min时，解吸率均在93%以上，当洗脱流速大于1.5 mL/min后，解吸率急剧下降，当洗脱流速达到3.0 mL/min时，树脂的解吸率低至65.5%。由试验可知，低流速增加接触时间，有利于树脂与样品进行物质交换，但考虑低流速耗时长、效率低等原因，最终选择1.0 mL/min作为最佳上样流速，1.5 mL/min为最适洗脱流速。

2.2.3.2 上样液质量浓度对单宁吸附的影响。

由图3可知，

上样液质量浓度对树脂吸附性能影响较大。随着上样液质量浓度的增大，吸附量逐步上升，而吸附率逐渐下降。降低上样液质量浓度会导致树脂的工作效率不高，不能充分发挥树脂的吸附能力；而较高的上样液质量浓度则会使吸附率降低，虽具有较高的吸附量，但吸附效果不佳。当上样液质量浓度为1.01 mg/mL时，吸附率达到92.33%，吸附量为9.33 mg/g，二者均处于较高的水平；而当上样液质量浓度为1.13 mg/mL时，吸附量和吸附率分别达到10.27 mg/g和90.88%，大孔树脂也处于较好的工作状态。但考虑到实际生产生活中对试验材料的使用情况，选择较低的上样液质量浓度1.01 mg/mL作为蕨麻单宁最适的上样液质量浓度。

2.2.4 不同纯化方法对单宁纯度的影响。通过不同纯化方法得到的单宁样品纯度存在差异。经试验测定，粗提液样品的单宁纯度为9.33%，大孔树脂纯化样品的单宁纯度为59.72%，乙酸乙酯萃取样品的单宁纯度为36.65%，乙酸乙酯萃余样品的单宁纯度为32.87%，萃取样品和萃余样品分别经大孔树脂二次纯化后得到的样品单宁纯度分别为81.09%和75.43%。粗提液经大孔树脂纯化和萃取分离后，样品纯度均有较大提高，其中经大孔树脂纯化的单宁样品表现更佳，纯度可以达到原来的6.4倍。此外，采用大孔树脂与乙酸乙酯萃取联用的二次纯化方法也可以有效提高蕨麻块根中单宁提取物的纯度。

2.3 蕨麻单宁的抗氧化活性

2.3.1 DPPH·的清除效果考察。

图4显示，6种样品对DPPH·的清除能力均随着样品浓度的增大而提高，在浓度为0.05 mg/mL时达到最大。同等浓度下，各纯化方法得到的蕨麻单宁样品的清除能力均强于抗坏血酸溶液，具有较好的活性。当样品浓度为0.05 mg/mL时，各样品对DPPH·的清除率从大到小依次为单宁酸（93.65%）＞乙酸乙酯萃取物（93.01%）＞大孔树脂纯化物（88.63%）＞乙酸乙酯萃余物（82.03%）＞萃取经大孔树脂纯化物（79.52%）＞粗提液（77.50%）＞萃余经大孔树脂纯化物（74.21%）＞抗坏血酸（66.84%）。所有样品对DPPH·的清除率均低于同等浓度下的单宁酸标准溶液，其中粗提液经乙酸乙酯萃取制得的样品溶液抗氧化能力最高，与单宁酸较为接近。在浓度0.05 mg/mL 时，乙酸乙酯萃取得到的样品溶液对DPPH·的清除率达到93.01%，是抗坏血酸溶液的1.4倍；同等浓度下，单宁酸溶液对DPPH·的清除率为93.65%，粗提液及其经大孔树脂纯化样品的清除率分别为77.50%和88.63%。由此可见，适当的纯化方法能显著提高蕨麻单宁对DPPH·的清除能力，其中乙酸乙酯萃取方法纯化的单宁样品对DPPH·的清除能力较优。对比图4也可以看出，多次通过大孔树脂及有机溶剂萃取的操作可能导致样品溶液中部分单宁的活性降低［3］，甚至低于未经纯化处理的粗提液，在实际工作中可依據情况缩减纯化次数。

2.3.2 · OH的清除效果考察。由图5可知，在试验浓度范围内，6种样品溶液对·OH均具有较好的清除能力。当样品浓度为0.50 mg/mL时，各样品对·OH的清除率从大到小依次为抗坏血酸（95.81%）＞大孔树脂纯化物（76.55%）＞粗提液（72.09%）＞萃余经大孔树脂纯化物（67.94%）＞单宁酸（65.99%）＞乙酸乙酯萃余物（64.78%）＞乙酸乙酯萃取物（60.88%）＞萃取经大孔树脂纯化物（58.38%）。其中，抗坏血酸溶液对·OH的清除能力极强，在浓度为0.50 mg/mL时清除率达到了95.81%，而第二位的大孔树脂纯化样品仅为76.55%。在对·OH的清除试验中，经大孔树脂纯化得到的样品溶液的抗氧化能力高于经乙酸乙酯萃取得到的样品溶液；且部分样品的清除率高于相同浓度的单宁酸标准品溶液，有别于DPPH·的清除试验。从图5可以看出，所有经过乙酸乙酯萃取操作的纯化样品对·OH的清除能力均小于未经处理的粗提液。大孔树脂纯化和乙酸乙酯萃取2种纯化方法除去的杂质成分存在差异，其中可能包括部分强抗氧化活性成分，导致不同纯化样品间对DPPH·和·OH的清除效果变化较大。

3 结论

该研究探讨了大孔树脂纯化和有机溶剂萃取2种方法对蕨麻块根单宁成分的分离纯化情况。首先考察了大孔树脂型号、上样浓度、洗脱浓度、上样流速和洗脱流速等因素对蕨麻单宁纯化效果的影响；其中X-5型大孔树脂对蕨麻单宁的分离纯化效果最好，且最佳上样浓度为1.01 mg/mL、上样流速为1.0 mg/mL、洗脱流速为1.5 mg/mL、洗脱剂为60%乙醇溶液。通过比较大孔吸附树脂、有机溶剂萃取等不同纯化方法对提高蕨麻单宁样品纯度的效果，证明大孔树脂吸附和乙酸乙酯萃取二者联用的方法可以显著提高蕨麻单宁样品纯度；但纯化步骤较多，会导致所得样品中单宁成分的抗氧化活性降低，在实际生产应用中还需进一步考量。

在抗氧化活性试验中，蕨麻单宁对DPPH·和·OH均表现出较好的清除能力，对DPPH·的清除能力甚至远高于同等浓度下的抗坏血酸溶液，未来可作为一种天然的抗氧化剂投入更广阔的开发和利用。蕨麻单宁对DPPH·的清除率略低于相同浓度的单宁酸标准溶液，说明初步的大孔吸附树脂及有机溶剂萃取等分离纯化方法虽能有效提高单宁样品的纯度，但蕨麻块根中所含单宁类物质种类繁多，后续可使用更精细的分离操作得到抗氧化活性更强的单体物质，针对性地应用于各种研究生产中。

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