生姜枯萎病致病菌的鉴定与生物药剂筛选

范天宇 朱书兴 缪才凌 杨秋华 李鑫 孙向成 黄科

摘要 ［目的］探明生姜幼苗枯萎病致病菌与生物药剂筛选。［方法］通过形态学鉴定与ITS系统发育树分析，并进行回接与生物防治试验。［结果］菌株zj1在PDA培养基上菌落圆形、乳白色，分生孢子镰刀状；基于ITS构建的进化树，菌株zj1鉴定为Fusarium graminearum；致病菌回接生姜幼苗后，引发生姜叶片失绿，与田间原发病症一致。F.graminearum在10～30 ℃均能生长，在 25～30 ℃生长效果较好；杀菌剂春雷霉素与农用链霉素对致病菌均有毒力，EC50分别为15.08与343.32 mg/L，盆栽试验结果相对防效为55.78%与51.23%。［结论］引起重庆荣昌生姜枯萎病的致病菌是禾谷镰刀菌，有效成分6%春雷霉素和72%农用链霉素均能对禾谷镰刀菌有很好的防治效果。

关键词 生姜；枯萎病；禾谷镰刀杆菌；生物药剂

中图分类号 S 436.32  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2023）12-0124-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.12.029

Identification and Biological Control of the Pathogens of Leaves Yellows in Ginger

FAN Tian-yu1，2，ZHU  Shu-xing1，2，MIAO  Cai-ling1，2 et al

（1.College of Biology and Food Engineering，Chongqing Three Gorge University， Chongqing 404120;2.College of Landscape Architecture and Life Science（Institute of Special Plants），Chongqing University of Arts & Sciences，Chongqing 402160）

Abstract ［Objective］To explore pathogens of Fusarium wilt of ginger seedlings and screen biological agents.［Method］Morphological identification and ITS multi-gene phylogenetic analysis were used to identify the species of pathogens.Furthermore，pathogens inoculation and prevention tests were also performed.［Result］The morphological results showed the colony of pathogens was round，milky white on PDA medium and the macroconidiums were sickle shape.The strain of zj1 was identified as Fusarium graminearum based on the evolutionary tree constructed by its ITS gene sequences.The leaves were chlorisis，which was similar with symptoms in filed after ginger seedlings inoculated by pathogen spores suspension.On top of that，F.graminearum proliferated from 10 to 30 ℃and the best proliferation temperature was both on 25 and 30 ℃.Both kasugamycin and streptomycin biocides had virulence effect on F.graminearum and the value of EC50 was 15.08 and 343.32 mg/L，respectively.Meanwhile the relative controlling effect of kasugamycin and streptomycin arrived 55.78% and 51.23%.respectively in greenhouse pot test.［Conclusion］F.graminearum was the cause agent of ginger Fusarium wilt in Rongchang.Effective ingredients of 6% Kasugamycin and 72%  streptomycin biocides were effective prevention on F.graminearum.

Key words Ginger;Fusarium wilt;F.graminearum;Biological agents

基金项目 重庆市人力资源和社会保障局项目“基于“鲁中大姜” 新品种应用的乡村振兴实用人才培训”（2021-388-4）。

作者简介 范天宇（1994—），女，四川达州人，硕士研究生，研究方向：食品加工。 *通信作者，副教授，博士，从事经济植物栽培与病害绿色防控研究。

收稿日期 2022-12-09

生姜（Zingiber officinale Roscoe）是药食同源植物。生姜无性繁殖过程中易累积大量细菌、真菌、虫卵等致病微生物，导致生姜在储藏、生产过程中易发生腐烂、细菌性枯萎、叶斑等病症［1-2］。生姜枯萎病的主要致病菌是镰刀杆菌（Fusarium spp），其病症是生姜叶缘发黄、卷曲，并逐渐扩展到整个叶片［3-4］。镰刀杆菌通过种传（seed-born）和土传（soil-born）在宿根中不斷累积，在生姜繁殖时发生病症，新生幼芽黄萎、无活力甚至坏死［5-6］。镰刀杆菌（Fusarium spp.）是重要的植物病原菌，寄主范围广，还能引起其他寄主发生萎蔫、根腐、穗腐、茎腐等病害［7-8］。

长江上游的四川东部、重庆等地是生姜主要栽培区，在调查该区域生姜病害时发现生姜出芽后，叶缘发黄、卷曲，植株缺乏活力，发育迟缓，随着病症加深，整叶失绿、黄化，病症严重的叶片枯萎，植株顶端枯死，给当地姜农造成严重损失。为查明重庆生姜叶黄病的致病原因，笔者从病症植株中分离、鉴定潜在的致病菌，并通过回接试验检测其致病力，然后筛选常用的生物药剂，旨在为生姜枯萎病的绿色防控提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离与纯化

枯萎病症生姜叶片采集自荣昌区盘龙镇生姜主栽培区。病症样品用清水冲洗，去除表面污渍，在病、健交界处剪取2～3 mm长的病组织，然后用无菌水冲洗2 min，重复3次，用0.6% NaClO浸泡3 min，用无菌水冲洗5 min，重复3次，经无菌滤纸吸干，移至PDA固体培养基（100 g马铃薯滤液， 葡萄糖 10 g， 琼脂粉 12 g），25 ℃培养5 d，每天观察并记录菌落形态。纯化菌落编号并在PDA平板连续培养3代，纯化菌株储藏于终浓度15 %的甘油中-80 ℃保存。

1.2 菌株的致病性鉴定

生姜种植于40 cm×40 cm 营养钵中，发育60 d 后，植株高度约31 cm，约8 片真叶。生姜发育过程中使用有效成分43%的福菌·肟菌酯（氟吡菌酰胺21.5%，肟菌酯21.5%）1 500倍稀释喷雾，接种前15 d，停止用药。纯化菌株置于PDA培养基，25 ℃培养7 d，制备浓度为105 CFU/mL的孢子悬液，喷雾接种于盆栽生姜叶片。喷雾后，每天观察生姜发育情况，每间隔5 d 统计植株发病率与病情指数。病株分级标准参考文献［6］执行。0级为健康植株，叶片无病症；1级为叶片10%以下区域出现黄化；2级为叶片25 %以下区域出现黄化；3级为叶片50 %以下区域出现黄化；4级为叶片75 %以下区域出现黄化；5级为叶片75%以上区域出现黄枯、坏死。病情指数 =（各级病叶数×相对级别叶数）/（检查总叶片数×5）×100。

1.3 菌株ITS序列分析

提取病原菌总DNA并以其为模板，真菌通用引物ITSl （5′-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3′）;ITS4 （ 5′-TCCTCCGCTTAT- TGATATGC-3′）为引物，利用PCR扩增技术扩增病原菌ITS核酸片段，引物由上海生物有限公司合成。PCR扩增反应体系：总体积为25 μL，引物ITS1/ITS4 0.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L） 2.5 μL，10×PCR Buffer（含MgCl2 25 mmol/L） 2.5 μL，DNA模板1.0 μL，TaqDNA酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 17.5 μL，扩增条件以标准PCR扩增条件为准。利用软件对扩增后的ITS序列，在美国国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI，http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源性分析，用ClustalX1.83与MEGA5［9］软件采用Neighbor-Jonining［10］法构建系统发育树以更直观地表示其同源关系。尖孢镰刀杆菌（F.oxysporum，MH911386.1）作为外群。

1.4 温度对F.graminearum生长特性的影响

取活化后长势较好的菌株，用直径8 mm的打孔器将菌落接种到PDA平板培养基中央，每个平板接1块菌饼，并设置3个重复。分别放置于（10±1）、（15±1）、（20±1）、（25±1）、（30±1）℃的培养箱中培养。每天用垂直十字交叉法测量菌落直径，最后取平均值［11］。在培养箱中培养后测量得出的菌落直径减去菌饼的直径即为菌落的直径，菌落直径再除以天数即是菌丝每天的生长速度。菌落生长速率=（菌落直径-菌饼直径）/天数［12］。

1.5 杀菌剂对菌丝生长的抑制试验

选择田间常用的6%春雷霉素和72%农用链霉素（华北制药股份有限公司），并采用菌丝生长速率测定法［13-14］检测2种生物杀菌剂对致病菌菌丝的生长抑制率。在50 ℃的PDA培养基中加入春雷霉素或农用链霉素，以不加药剂的平板作为对照，并在PDA培养基中加入60 μg/mL的氨苄青霉素抑制细菌生长。春雷素的浓度分别为6、12、18、24 mg/L；农用链霉素的浓度分别为33.6、100.8、168.0、235.2 mg/L。用直径8 mm的打孔器将菌落接种到不同浓度的春雷霉素和农用链霉素的PDA培养基上，25 ℃培养，每次试验重复3次。2 d 后，得到不同大小的菌落，用十字交叉法测量菌落生長直径，并计算抑菌率，抑菌率=（空白对照菌丝-8）-（药剂菌丝-8）/（空白对照菌丝-8）。将抑菌率换算成抑制概率值，将抑制概率值作为因变量（y），药剂质量浓度转换为10为底的对数值为自变量（x），做回归直线，求出毒力回归方程和相关系数，并运用最小二乘法计算EC50［15-16］。

1.6 盆栽防效试验

生姜宿根50 g种植于36  cm×40 cm 营养袋60 d后，植株发育高度约32 cm，萌发7～8叶。 制备105 CFU/mL 的孢子悬液侵染生姜幼苗，对照组用无菌清水喷雾。喷雾5 d后，使用浓度为18 mg/L的春雷霉素与340 mg/ L的农用链霉素素每间隔7 d 用药一次，连续用药3次，在最后1次用药14 d后调查发病情况，计算相对防治效果=（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数×100%［17-18］。

1.7 数据分析 采用Excel软件和Origin2019b软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离鉴定

从叶片失绿、黄化，植株缺乏活力，发育迟缓的植株叶片（图1A）中分离致病菌（zj1）。致病菌（zj1）在PDA培养基培养后，形成圆形、乳白色菌落（图1B），菌落背面产生红色色素，菌丝稀松，绒毛状，分生孢子镰刀状，多数分生孢子3隔，产生球形孢囊（图1C）。

2.2 ITS序列分析結果

将PCR扩增产物进行纯化后进行基因组的测序再用软件进行比对分析，结果显示，供试菌株的ITS序列（ 2248417 ）与F.graminearum（MH681145.1）的同源性达99.5%。然后通过MEGA 4.1 软件中的neighbor joining方法（邻接法）建立菌株zj1的系统发育树（图2），根据菌落形态检测及ITS序列分析分离、鉴定的菌株zj1为禾谷镰刀菌属（F.graminearum）。

2.3 温度对F.graminearum 生长的影响 将F.graminearum在10、15、20、25、30 ℃时培养，测量菌丝生长速率，F.graminearum在10、15和20 ℃生长相对较慢；在25、30 ℃时生长显著增加，在检测的5 d内，菌落在第3天生长速率最快，在30 ℃生长速率1.44 cm/d高于25 ℃的1.31 cm/d（P<0.05）；在第4天和第5天生长速率下降，此时，F.graminearum生长速率差异不显著（P>0.05）（图3）。

2.4 回接试验致病性

将致病菌回接盆栽生姜幼苗，侵染早期5 d后，部分叶片出现黄色斑点，随着侵染加深，病灶扩展，病症加深，叶片上形成多个病斑，叶缘卷曲、整个叶片枯黄、部分叶片掉落，接种无菌清水生姜叶片，未见叶片枯黄发病症状（图4A）。在调查40 d内发病率和病情指数均增加；发病率由5 d 的8.5%增加到40 d的97.7%，发病率在10～35 d显著增加，35～40 d变化不显著（图4B）。病情指数由5 d 的5.0增加到40 d的36.5，病情指数在10 ～30 d显著增加，30～40 d变化不大（图4C）。对病症中致病菌进行分离、培养，形态特征鉴定为镰刀杆菌。

2.5 生物药剂对F.graminearum的毒力与防效

采用的2种生物杀菌剂对禾谷镰刀杆菌平板毒力抑制试验表明，6%春雷霉素和72%农用链霉素对F.graminearum均有毒力（表1），6%春雷霉素的EC50为15.08 mg/L。72%农用链霉素的EC50为343.32 mg/L。盆栽药效试验表明，18 mg/L 6%春雷霉素对盆栽60 d生姜幼苗叶黄病的防效比340 mg/L 72%农用链霉素的防效高（P<0.05），分别为55.78%和51.23%。

3 结论与讨论

该研究从生姜枯萎病叶片中分离了1株禾谷镰刀杆菌，禾谷镰刀杆菌不仅能引起谷类作物如小麦赤霉病、玉米茎腐病，还能产生大量毒素威胁人畜健康［19-21］。因此，研究生姜枯萎病的病原菌及其生物药剂筛选既可促进生姜安全生产，又可提高食品安全。

温度对F.graminearum的生长特性研究表明，在10～30 ℃培养条件下，F.graminearum的生长速度随温度的升高而加快，25与30 ℃生长速率较快，这与茄病镰刀杆菌的生长特性一致［22］。而川东与重庆沿江地区生姜幼苗叶黄病的发病时期为4月下旬至5月下旬，此时该区域日间温度均高于25 ℃，较有利于F.graminearum 在生姜中的繁殖累积。研究表明F.graminearum 在生姜宿根中累积越冬，次年栽培发育的早期，镰刀菌在生姜体内繁殖侵染，造成植株畸形、黄叶、枯萎［5］。

F.graminearum 喷雾回接生姜幼苗后，5 d 后出现病症，25 d 后，随着病症的加深，发病率和病情指数显著上升，叶片开始出现枯萎、凋落。这一病症与生姜细菌性枯萎病快速发病的特点不一致，生姜细菌性枯萎病暴发具有突发、快速的特点［23-24］，与镰刀菌引发生姜的病症及发病周期一致［5-6］。

春雷霉素和农用链霉素是防控真菌病害的常用生物药剂，2种杀菌剂对F.graminearum 的菌丝生长均有抑制作用，同时2种杀菌剂在安全用药范围内对生姜叶黄病的盆栽防效达50%以上，可作为备选杀菌剂在田间交替使用，替代化学杀菌剂防治生姜枯萎病，达到病害绿色防控的目的，实现生姜的安全生产。

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