蓝莓无糖组培关键技术因素研究*

陈相涛，陈芳芳，王 方，郇伟伟，李 洁，李小白

（1 杭州木木生物科技有限公司，浙江 311300）（2 杭州市临安区农业农村局）（3 浙江农林大学化学与材料工程学院）（4 浙江省农业科学院）

蓝莓作为兼具营养和保健作用的美味水果，其富含酚类物质如绿原酸，以及典型的黄酮类物质如槲皮素、花青素、儿茶素、表儿茶素等[1-4]。这些物质具有良好的抗氧化活性，具有预防黄斑变性、抗癌、防治阿尔茨海默病[5-7]、降低心脏病风险[8-9]、降低胆固醇[10]等功效。因此，其深受百姓喜爱，被誉为“第三代水果”。蓝莓属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium），目前栽培的蓝莓主要由4 种蓝莓杂交而成，分别为四倍体高丛蓝莓、二倍体和四倍体矮丛蓝莓、六倍体兔眼蓝莓，以及来自多倍体杂交的五倍体和非整倍体蓝莓[11-12]。高丛蓝莓又可细分为两大类，即北高丛蓝莓和南高丛蓝莓[12]。南高丛蓝莓需冷量一般为200～400 h，远远低于北高丛蓝莓800～1 200 h。目前，国内主要栽培的蓝莓品种主要是这两大类。蓝莓种植区域从美洲（主要是美国、加拿大和墨西哥）延伸至欧洲（主要是波兰、西班牙、俄罗斯）、亚洲（主要是中国、日本）和澳大利亚，目前已经扩展至非洲（如赞比亚）。我国蓝莓产业虽然起步较晚，但近年来发展迅猛，种植面积逐年增加，全国蓝莓栽培面积从2000 年的仅10 hm2发展到2020 年的6.64 万hm2，一跃成为全球最大的蓝莓种植地[13]。因此，近几年国内对蓝莓种苗需求井喷式地暴发。

传统蓝莓种苗繁殖主要靠扦插以及传统组培，但扦插的效率太低，而且有严格的季节限制，无法应用于大规模种苗生产。传统组培繁殖系数远高于扦插，而且一年四季皆可进行操作，但其存在一定的缺陷，尤其是成苗后移栽成活率较低一直是最大的问题，而且培养基中的糖分很容易引起污染而造成损失。20 世纪80 年代末，日本学者提出了无糖组织培养技术即光自养组织培养技术[14]。其原理是以输入二氧化碳气体作为碳源，以此替代传统培养基中的糖，让植物通过光合作用自身合成糖，使试管苗由兼养型转变为自养型。强制通气（即通过二氧化碳富集进行气体交换）使扦插植物的净光合速率提高了30～40 倍[15]，使幼苗的存活率提高了35%[16]。此类组织培养可在很大程度上提高苗木质量，具有壮苗、加速生长、移栽成活率高等优点[14]。也可节省蔗糖，降低生产成本，降低组培苗污染率，提高驯化移栽苗的效率。目前，人们已经对木本植物杜仲[17]和欧李[18]，以及草本植物红掌[19]和满天星[20]等的无糖组培配方进行了研究和开发，包括不同植物生长调节剂种类和浓度、不同培养液浓度等，但尚未有蓝莓无糖组培研究的任何报道，亟须对该技术在蓝莓中的几个关键技术问题进行探索。在蓝莓的常规组培研究中已经发现，IBA、NAA 和ABT 等植物生长调节剂对植株的生根有重要作用[21]，在无糖组培的液体培养基中，这些植物生长调节剂也同样需要重视。另外，由于无糖组培的特殊环境，固体基质和营养液的配比（固液比）对植株生根也有重要影响。固液比过高，固体基质更容易起到支撑作用，但影响植物的营养吸收；固液比过低，虽然植物更容易吸收营养，但固体基质支撑作用会被减弱，且浪费营养液而增加成本。虽然无糖组培去除了糖和有机质而减少了污染率，但污染现象还是存在，通过抑菌剂可进一步降低污染率。因此，笔者针对植物生长调节剂、固液比以及抑菌剂进行探讨，建立了一套实用的蓝莓无糖组培方案，为蓝莓产业优质种苗生产提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为杭州木木生物科技有限公司前期生产的绿宝石蓝莓常规组培苗，挑选培养60 d 并且生长健壮的蓝莓苗进行无糖培养。

1.2 试验方法

1.2.1无糖基质的准备、接种和培养

以去除有机组分、糖和琼脂的改良WPM 培养基（杭州木木生物科技有限公司）为基本营养液，以1～3 mm 的蛭石颗粒为固体培养基质。配好的营养液与基质按一定比例混合后，装入培养容器内，基质厚度为3～4 cm。将配制好的培养基质与容器一起高压灭菌，灭菌条件为：121 ℃，30 min。在超净工作台上，将生长健壮的蓝莓增殖苗去除顶部和基部之后，修剪成2～3 cm 的茎段，插入装有上述基质的无糖盒中，放入培养室内培养。暗培养3 d后，提供光照和二氧化碳。设定培养室内的二氧化碳浓度为0.12%，光照强度为10 000 lx，光照时间为16 h/d，培养温度保持在（25±2）℃。

1.2.2不同植物生长调节剂及浓度对蓝莓苗生根的影响

设计4 个不同植物生长调节剂及浓度处理：T1，改良WPM＋0.1 mg/L IBA；T2，改良WPM＋0.5 mg/L IBA；T3，改良WPM＋1.0 mg/L IBA；T4，改良WPM＋1.0 mg/L NAA。固液比为1.8 L 蛭石＋1.25 L 营养液，pH 值调至5.2 左右。每个处理制备5 个无糖盒，每个无糖盒接种300 株。分别在培养30 d 和60 d时，从每个无糖盒中随机选取50 株，测量蓝莓苗根系数量和长度，计算平均值，并统计生根率。

1.2.3不同固液比对蓝莓苗生根的影响

为保证整个生长过程都有充足的水分，设计3个不同固液比处理：T5，1.8 L 蛭石＋1.1 L 营养液；T6，1.8 L 蛭石＋1.25 L 营养液；T7，1.8 L 蛭石＋1.4 L 营养液。营养液为改良WPM＋1.0 mg/L IBA，pH值调至5.2 左右。每个处理制备5 个无糖盒，每个无糖盒接种300 株。分别在培养30 d 和60 d 时，从每个无糖盒中随机选取50 株，测量蓝莓苗根系数量和长度，计算平均值，并统计生根率。

1.2.4不同抑菌剂在无糖组培中的应用

在营养液中分别添加4 种不同的抑菌剂：T8，1 g/L 多菌灵（四川国光农化股份有限公司）；T9，2 g/L 山梨酸钾（西安晋湘药用辅料有限公司）；T10，25 mg/L 氯霉素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；T11，2 mL/L 植培净（杭州木木生物科技有限公司）。营养液为改良WPM＋1.0 mg/L IBA，固液比为1.8 L 蛭石＋1.25 L 营养液，pH 值调至5.2左右。每个处理制备8 个无糖盒，高温高压灭菌，灭菌条件为：121 ℃，30 min。经过灭菌之后接种蓝莓苗，接种后放入培养室内培养。每隔15 d 观察污染情况，并记录污染率。

1.3 数据分析

在植物生长调节剂和固液比的试验中，根系数量、根系长度和生根率的统计是不计污染个体的。采用SPSS 22.0 软件对数据进行分析，利用LSD 方法进行统计学检验。

2 结果与分析

2.1 不同植物生长调节剂及浓度对蓝莓苗生根的影响

如表1 所示，T1、T2 处理的蓝莓苗根系数量、根系长度和生根率均与T3、T4 处理存在显著差异。在T1 处理培养30 d 的情况下，生根率为0；在培养60 d 的情况下，蓝莓苗有生根表现，生根率为61.77%。随着IBA 浓度的增加，T2、T3 处理的蓝莓苗根系数量、根系长度和生根率相较于T1 处理均有显著提高，T3 处理的这些性状均显著优于T2处理。T3、T4 处理的蓝莓苗根系数量、根系长度和生根率之间差异均不显著。这些结果说明IBA 浓度增加能够显著改善蓝莓苗的生根情况，在1.0 mg/L IBA 的情况下即可达到蓝莓种苗的生产需求。2 种植物生长调节剂在1.0 mg/L 浓度下对蓝莓苗生根的影响差异不大，对蓝莓苗根系生长的促进作用类似。

表1 不同植物生长调节剂及浓度对蓝莓苗生根的影响

2.2 不同固液比对蓝莓苗生根的影响

如表2 所示，3 个固液比处理的蓝莓苗根系数量、根系长度和生根率之间均存在差异。在T5 处理培养30 d 的情况下，生根率为0；在培养60 d 的情况下，蓝莓苗有生根表现，生根率为31.85%。T6处理的蓝莓苗根系数量、根系长度和生根率均显著高于T5 处理。T7 处理的蓝莓苗根系数量、根系长度和生根率均显著高于T5 处理；在T7 处理培养30 d 的情况下，蓝莓苗的根系数量和生根率均显著低于T6 处理；在培养60 d 的情况下，蓝莓苗的根系数量、根系长度和生根率与T6 处理均无显著差异。这些结果说明营养液比重的增加显著改善了蓝莓苗的根部性状，但当营养液过量时，蓝莓苗生长中期（30 d）的生根率受到了影响。

表2 不同固液比对蓝莓苗生根的影响

2.3 不同抑菌剂在蓝莓无糖组培中的应用

4 种抑菌剂对蓝莓无糖组培苗的抑制污染效果如表3 所示。在培养15 d 时，4 种抑菌剂处理的蓝莓苗均无污染产生。在培养30 d 时，T10 处理的蓝莓苗污染率为10.53%，而其他处理的蓝莓苗均未发现污染情况。在培养45 d 时，T8、T9 处理的蓝莓苗也出现了污染情况，但T8、T9 处理的污染率均显著低于T10 处理。在培养60 d 时，4 种抑菌剂处理的蓝莓苗均出现了污染情况，且污染率存在显著差异，抑菌效果表现为：T11 处理＞T9 处理≈T8处理＞T10 处理。T11 处理的抑菌效果最好，能够有效降低污染率至13.65%（图1）。

图1 蓝莓无糖组培苗和组培盒

表3 不同抑菌剂在蓝莓无糖组培中的污染率 %

3 讨论

3.1 不同植物生长调节剂及浓度对蓝莓苗生根的影响

本研究结果显示，蓝莓无糖组培苗的根系数量和长度均随植物生长调节剂浓度的增加而增加，说明植物生长调节剂对于组培苗的生根起着关键作用。在改良WPM＋0.1 mg/L IBA 培养30 d 的情况下，蓝莓苗基本不生根，但随着培养时间的增加，即使在较低的IBA 浓度下，蓝莓苗也开始生根。这可能与培养后期水分蒸发进而提高了IBA 浓度有关。另外，对比2 种植物生长调节剂可以发现，IBA 和NAA在1.0 mg/L 浓度下，对蓝莓苗根系生长的促进作用差异较小，均取得了较好的生根效果。这与李子杰等[22]报道的常规组培生根培养基中植物生长调节剂水平相当（改良WPM＋1.0 mg/L IBA）。当然也与许多常规生根培养基的植物生长调节剂水平具有一定差异，例如肖海峻等[21]研究发现，蓝莓瓶内最佳生根培养基（1/2 WPM＋2.0 mg/L IBA＋0.2%活性炭）中IBA 浓度达2.0 mg/L，而在程磊等[23]研究的最佳组培苗生根培养基（1/2 WPM＋20 g/L 蔗糖＋0.5 mg/L IBA＋10.0 g/L 活性炭）中，IBA 浓度只有0.5 mg/L，这可能是由于较高的糖为植株提供了充足的碳源，从而减少了其对植物生长调节剂刺激的依赖。植物生长调节剂水平低虽然不容易引起组培苗变异，但会严重拉长整个生长周期，造成生根效果较差、根系细弱，不利于种苗生产。本试验中，在改良WPM＋0.1 mg/L IBA 处理培养30 d 的情况下，蓝莓苗基本不生根，而且培养后期根系也较弱。相反，植物生长调节剂水平过高则容易诱导形成愈伤组织和变异，也不利于种苗生产。因此，在本试验中植物生长调节剂水平控制在1.0 mg/L 以内。文献已经报道IBA 和NAA 较IAA 的生根促进作用更好，这是因为IAA 易被氧化分解而失效，因此本试验使用IBA 和NAA 这2 种植物生长调节剂均取得了良好效果。

3.2 不同固液比对蓝莓苗生根的影响

在无糖组培中固体基质与营养液的比例是至关重要的，这直接影响植株与营养液的接触[16]。固液比过高，虽然容易支撑植株，但会影响植物接触营养液，从而造成其营养吸收困难；固液比过低，虽然植物更容易吸收营养，但固体基质支撑作用会被减弱，浪费营养液而增加成本，更为重要的是容易造成植物根系呼吸困难，导致烂根。本试验对3个不同固液比进行了研究，发现1.8 L 蛭石＋1.1 L和1.25 L 营养液均对蓝莓苗茎段的接种操作较为容易，但1.8 L 蛭石＋1.1 L 营养液的固液比过大，造成植株吸收营养困难，因此影响了其生根率。1.8 L蛭石＋1.4 L 营养液的固液比偏小，营养液偏多，不利于蓝莓苗茎段的接种操作。因此，1.8 L 蛭石＋1.25 L 营养液对蓝莓无糖组培较为合适，在培养中期有利于生根，并且根系质量最好，但在培养后期，由于水分蒸发，根系生长减缓，蓝莓苗生长也开始停滞。而过多的营养液（1.4 L）在培养初期和中期均影响了根系的诱导和生长，还造成了一定的烂根和死苗；培养后期由于水分蒸发，营养液的量趋于合理水平，最终导致1.25 L 和1.4 L 营养液对蓝莓苗根部性状的影响趋同。因此，在利用1.8 L 蛭石＋1.25 L 营养液的实践操作中，培养后期可以适当地增加营养液来保证植株能够吸收足够的营养，以期得到更好的效果。

3.3 不同抑菌剂在蓝莓无糖组培中的应用

虽然无糖组培去除了最容易造成污染的糖分和有机组分，但由于无糖盒的面积较大，接种操作过程时间较长，另外接种的组培苗容易携带原组培瓶内的有糖培养基，这些因素都有可能造成无糖组培中蓝莓苗的污染。因此，需要添加有效的抑菌成分，才能确保植株的正常生长。多菌灵主要干扰病原菌有丝分裂中纺锤体的形成从而影响细胞分裂，以此达到杀菌作用，其对多种真菌都有效果[24]。氯霉素属广谱抑菌剂，可作用于细菌核糖核蛋白体的50S 亚基，对革兰阴性菌以及革兰阳性菌都有比较强的抑菌作用，但对革兰阴性菌的作用强于革兰阳性菌[24]。山梨酸钾的抑菌机理主要是与微生物酶系统的巯基结合从而破坏许多酶系统的作用，其可有效抑制霉菌、好氧性细菌以及酵母菌活性，还可以防止葡萄球菌、肉毒杆菌以及沙门氏菌等微生物的繁殖，不过对厌氧性芽孢菌还有嗜酸乳杆菌等微生物是无效的，抑制发育作用要强于其杀菌作用[25]。植培净是一种长效、广谱、高活性、新型组织培养专用、防菌落污染的抑制剂，其不杀菌，却能够抑制菌落在培养基上萌发成菌丝，能够抑制孢子萌发转变为菌丝的过程，可使孢子（菌落）一直停留这种形态不萌发，直到组培苗出瓶。本研究使用4 种抑菌剂，用量均按照说明书建议的工作浓度，即发挥作用的有效浓度，研究发现，在抑菌剂作用下，蓝莓无糖组培苗的污染率较低，在培养15 d 时，蓝莓苗的污染率为0；在培养15 d 以后才陆续有污染情况出现；效果最差的是氯霉素，其培养60 d 时的最终污染率在40%以上；效果最好的是植培净，培养60 d 时的最终污染率只有13.65%。常规组培中的蓝莓茎段作为外植体接种特别容易污染，在接种1周后陆续出现污染现象[26]。在前期试验中发现，虽然继代和生根期间的组培污染率有所下降，但其污染率也还是高于无糖组培。在添加抑菌剂后，无糖组培在控制污染的优势上进一步突出，尤其是组培专用抑菌剂“植培净”克服了无糖组培中接种量大、接种时间长而产生的污染风险，其控制污染的效果明显优于其他3 种抑菌剂。

4 结论

蓝莓无糖组培技术较常规的组培有较大的优势。通过去除糖分和有机组分的液体培养基减少了污染，继而改用大容器培养，通过自然增加植株的适应性，得到较为健壮的苗木。本研究对蓝莓无糖组培中不同植物生长调节剂及浓度、固体基质与营养液比例以及抑菌剂的选择这3 个重要的影响因素进行了研究，发现改良WPM＋1.0 mg/L IBA/NAA 的营养液配方效果较好，1.8 L 蛭石＋1.25 L 营养液的固液比最佳，植培净的抑菌效果好于其他抑菌剂，在此条件下培养的蓝莓苗健壮、根系多、污染率低。