煮制对多花黄精多糖结构及其体外免疫刺激活性的影响

吴兰兰　吴钢　谭强来　林锦峰　甘淑娇　熊梅惠　吴伟菁

摘要：目的：煮制是多花黄精加工最常用的方法之一。探讨不同煮制温度及时间对多花黄精多糖构效关系的影响，为其在加工中高效利用和精准控制提供参考。方法：通过不同煮制条件获得的多花黄精多糖，采用FT-IR、离子交换色谱、GPC-MALLS等方法分析多糖官能团、单糖组成、分子量及分布等结构信息。结合小鼠巨噬细胞模型，评价不同煮制条件对黄精多糖促进免疫刺激活性的影响，包括细胞活力、一氧化氮分泌量。结果：煮制温度的升高及时间延长可促使黄精多糖中的阿拉伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸质量比升高，葡萄糖、木糖质量比降低；多花黄精有2个多糖峰；中低温度煮制条件下，多糖分子量随煮制时间的增加而降低。然而，高温煮制下可触发黄精多糖先发生聚集后再降解。RAW 264.7巨噬细胞一氧化氮分泌量结果表明，温度升高及延长煮制时间可破坏多花黄精多糖的免疫刺激活性。结论：煮制温度和时间改变多花黄精的结构并影响其免疫活性，因此在实际加工中，应避免过度加工，以防降低黄精功效。

关键词：多花黄精；多糖；煮制；结构；免疫活性

多花黄精为百合科黄精属草本植物[1]，是中国特色的药食同源类食品，其根茎具有良好的保健功能[2]。黄精食用前需经热处理去除对舌头及喉咙的刺激性。据文献记载，黄精加工主要有蒸、煮、“九蒸九制”等方式[3-6]。经典加工方法是将黄精与黄酒拌匀后，共同蒸制，实则为煮制。药典中提到煮制要点为炖透；且蒸、煮在一定程度上能够降低黄精的毒性，提升其效用[6-8]。

多糖是多花黄精的核心功能组分，也是其质量评价的关键指标[9-11]。已有研究发现，蒸制可使得多糖含量减少近一半[6， 12-13]。蒸制温度通常为100 ℃，因此，通过降低温度，可能有利于降低热加工对多糖含量的破坏，但现有研究多依照古法进行蒸制，鲜有探究温度对黄精多糖的影响。且多糖提取多采用热水浸提，类似于煮制，现有研究主要集中在煮制时间对多糖含量的影响[14-16]。与其他多糖不同，黄精多糖经热处理，尤其是100 ℃蒸制过程中多糖含量呈现下降趋势。可见，黄精多糖对加工温度和时间更加敏感，有必要探究温度及时间对于黄精多糖的影响[17]。

研究发现，生、熟黄精的多糖含量、分子量及单糖组成均有变化，说明在黄精加工过程中，多糖含量降低，多糖结构发生变化，同时多糖生理活性的变化，如抗氧化、降血糖等[18]，进而影响多花黄精的营养价值。但是鲜有研究加工过程中，黄精多糖结构变化对免疫刺激活性的影响。根据现有文献，黄精多糖结构在蒸制过程中虽然多糖含量显著下降，但是分子量增加，说明黄精多糖可能发生聚合[18]，然而其触发黄精多糖降解及聚合的温度和时间，尚不清楚。因此，基于优化黄精加工及其多糖的提取工艺，本研究通过不同温度及时间煮制多花黄精，随后分离多花黄精多糖。测定并分析黄精多糖的分子量、单糖组成等分子结构的变化。同时，基于RAW264.7巨噬细胞模型，分析煮制温度及时间对黄精多糖免疫刺激活性的影响，以期为多花黄精多糖在加工中高效利用和精准控制提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

多花黄精根茎（野生），采自福建省邵武市，由邵武市山乘山生态农业开发有限公司提供；RAW 264.7细胞，中科院细胞库（上海）；DMEM培养基及胎牛血清，上海Sigma公司；细胞计数试剂盒-8（CCK-8）、脂多糖（LPS），兰杰柯科技有限公司；NO试剂盒，碧云天生物技术有限公司。其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

电子天平（BSA224S），塞多利斯科学仪器北京有限公司；磁力搅拌器（JK-DMS），上海精学科学仪器有限公司；多功能酶标仪（Infinite M1000），奥地利Tecan公司；水浴锅（HWS-24），上海一恒科学仪器有限公司；分析天平（SECURA），塞多利斯科学仪器北京有限公司；傅里叶红外光谱仪（Alpha），德国布鲁克公司；离子交换色谱（ICS-3000），DIONEX， USA；液相色谱，Waters科技有限公司；多角度激光散射（DAWN EOS），美国怀雅特技术公司；示差检测器（OPTILAB DSP），美国怀雅特技术公司。

1.3方法

1.3.1多花黄精多糖的制备将多花黄精去须、洗净后切片，厚度约3 mm。置于50 ℃烘箱过夜后研磨成粉。取多花黄精粉末10 g，以料液比1：20（w/v）进行搅拌，温度梯度分别设置为60、80、100 ℃，在同一个温度度下，分别搅拌煮制2、6、12 h。获得的9种多糖溶液于10 000 r/min离心10 min，上清液加入4倍無水乙醇静置过夜，随后离心（5 000 r/min，2 min）收集沉淀，加水复溶后，冷冻干燥[19]，即得到不同煮制处理的多花黄精多糖。

1.3.2傅里叶变换红外光谱检测（FT-IR）取多花多糖样品与干燥的溴化钾研磨混合（1：200，w/w），压制成片。红外光谱扫描范围为400 ～4 000 cm-1[20-21]。

1.3.3多糖分子量的测定多黄黄精多糖采用MALLS-GPC测定其分子参数[22]。配制浓度为0.5 mg/mL的黄精多糖，充分混匀后，使用0.22 μm滤膜过滤，再利用配备有Wyatt多角度光激光散射和示差检测器的高效凝胶渗透色谱测定其分子量和平均分子量分布。流动相为0.1 mol/L硝酸钠，流速0.5 mL/min，dN/dC值为0.15。数据采用Astra软件进行分析。

1.3.4单糖组成的测定采用4 mol/L三氟乙酸溶液于120 ℃反应2 h，随后氮吹挥干液体。样品溶于10 mL的纯净水中，过0.22 μm膜后，上样10 μL。离子交换色谱仪配备脉冲安培检测器，色谱柱：Carbo PacTM PA20（3×150 mm）连接Carbo PacTM PA20 BioLCTM保护柱（3×30 mm）。流动相：超纯水（A）、250 mmol/L氢氧化钠溶液（B）、1 mol/L 醋酸钠溶液（C），流速1 mL/min [23]。具体梯度洗脱条件：0～20 min，流动相A：B：C为91：9：0；20～20.1 min，流动相A：B：C为86：9：5；20.1～40 min，流动相A：B：C为71：9：20；40～40.1 min，流动相A：B：C为0：100：0。

1.3.5小鼠巨噬细胞RAW 264.7的培养小鼠巨噬细胞RAW 264.7加入DMEM高糖培养基（含10%的胎牛血清、1%的双抗），置于37 °C、5%CO2的培养箱中培养。每天观察细胞生长状况，并及时更换新鲜培养基[24]。

1.3.6巨噬细胞活力的测定多花黄精多糖充分溶解在DMEM完全培养基中，配置成1 mg/mL的多糖母液。采用0.22 μm的无菌微孔滤膜过滤，随后加入适量DMEM完全培养基将其稀释成不同浓度梯度。多花黄精多糖对于巨噬细胞存活率的影响采用CCK-8法测定[25]。巨噬细胞计数后，以2×104个/孔，按照100 μL/孔播种于96孔细胞板中，过夜培养。随后，分別加入9种黄精多糖溶液100 μL，使其终浓度分别为6.25、25、100 μg/mL。空白对照组及阳性对照组分别加入100 μL的DMEM完全培养基及脂多糖（LPS，终浓度为2 μg/mL）。继续培养24 h后，小心弃去上清液，加入100 μL含有CCK-8的新鲜培养基，继续培养2 h。培养结束后于405 nm测定吸光值。每个样品设6个复孔。

1.3.7一氧化氮（NO）释放量的测定细胞播种及样品反应同1.3.6。样品培养结束后，取上清液，采用Griess法测定上清液中NO含量[26]。每个样品设6个复孔。

1.3.8数据分析数据使用SPSS 23.0软件行统计学处理。结果以平均值±标准差（SD）表示，采用One-way ANOVA方差分析，事后比较采用邓肯分析，P<0.05为具有统计学差异。

2结果与分析

2.1多花黄精多糖傅里叶变换红外光谱（FT-IR）

由图1可知，采用不同煮制温度和时间，黄精多糖官能团的伸缩及振动区间及幅度未发生明显变化，同时存在多糖特征吸收峰。根据文献可知，3 403 cm^-1、2 933 cm^-1、1 733 cm^-1、1 641 cm-1吸收谱带分别是由-OH、C-H、C=O的伸缩振动引起[27-29]；1 020 cm^-1处吸收峰为吡喃环结构引起[30]；917 cm^-1、824 cm-1处吸收峰表明黄精多糖具有α-糖苷键和β-糖苷键[31]。图1结果表明，煮制加工工序未对黄精多糖的一级结构产生影响。

2.2煮制对多花黄精多糖单糖组成的影响

由图2可以看出，不同煮制条件下获得的多花黄精多糖的单糖组成主要有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸。煮制条件对多糖单糖组成的改变取决于煮制温度。低温煮制条件下（60 ℃），随着时间延长，单糖组成变化较小。但温度提高，单糖组成产生较大变化。60 ℃煮制2 h的黄精多糖中，葡萄糖质量比低于木糖质量比，然而高温煮制（80 ℃及100 ℃）2 h，图1不同煮制条件下获得的多花黄精多糖的红外光谱

葡萄糖质量比则高于木糖质量比。中高温度均可促使阿拉伯糖、半乳糖含量升高，葡萄糖、木糖降低。但高温促使这几类单糖组分变化的速率显著高于中温。且在100 ℃下，12 h的长时间煮制，使得黄精单糖组成由葡萄糖（占44.01%）、木糖（占37.99 %）为主，转变为半乳糖（占31.85%）、木糖（占30.71%）、葡萄糖（占29.10%）为主。另外，阿拉伯糖由2.26%提高至6.48%，半乳糖醛酸含量也显著提高。

通常情况下提高温度，有利于提高多糖的得率，但是不同于其他植物多糖，黄精多糖结构易受加工温度的影响。温度高于80 ℃，黄精多糖的单糖组成则随着煮制时间延长发生变化，尤其超过100 ℃，黄精多糖单糖组成变化速率增加，而黄精现有加工方式多为100 ℃，且加工时间多超过12 h。另有研究指出，不同温度及时间下提取的多花黄精多糖的单糖组成不同[28-29， 32]。因此，不同煮制温度与时间造成黄精多糖单糖组成的改变，可能是影响其生理活性的关键因素之一。已有研究报道，多花黄精多糖富含果糖[28-29]。红外光谱分析表明，多花黄精多糖中含有果糖。然而，本研究在预处理过程中通过强酸水解果糖，使其转化为甘露糖和葡萄糖[33]。因此，本研究的单糖成分中没有检测到果糖。

2.3煮制对多花黄精多糖的分子量的影响

附表为不同煮制温度和时间下，多花黄精多糖的分子参数：重均分子量（Mw）、数均分子量（Mn）、分子量分布Mw/Mn及均方根半径（Rz）[34-35]。通过MALLS-GPC分析可知，经过煮制后的多花黄精中的多糖存在2个峰。其中峰1为多花黄精多糖中高分子量组分（分子量Mw范围为2.246×105～7.476×105）。相同煮制时间下，高温煮制的黄精多糖分子量均高于低温煮制的黄精多糖。60 ℃和80 ℃的多糖Mw值随着煮制时间延长而降低，12 h后分别降低26.1%和24.8%，但其Mw/Mn值均大于3，表明通过煮制后的多糖发生降解，产生不均一聚合物。然而，在100 ℃条件下，随着煮制时间延长Mw值先升后降。煮制6 h的黄精多糖的Mw值较2 h煮制增加67.8%。虽然煮制12 h后Mw比煮制6 h小，但大于2 h煮制后的多糖Mw。Mw/Mn值由5.656降至1.897，表明随着温度升高及时间的推移，多糖分子量分布变窄，即在100℃条件下，黄精多糖可能先聚集后随着时间延长发生降解。峰2多花黄精多糖中为低分子量组分（分子量Mw范围为6.110×103～9.851×103）。60 ℃和80 ℃长时间煮制（12 h）条件下的多糖Mw值低于煮制2 h后的黄精多糖的分子量。100 ℃多糖Mw值随着煮制时间延长呈先上升后下降。但12 h煮制下的多糖Mw仍然高于煮制2 h。3个温度下煮制不同时间的Mw/Mn值均大于1.2，与峰1相比，小分子量的聚合物分子量分布较窄，聚合物均一性较峰1好。试验结果表明，100 ℃高温煮制条件下，黄精多糖可产生聚集形成更大分子量的黄精多糖，而相对中低温条件下，则无此现象。随着时间延长，黄精多糖逐渐降解。因此，煮制的温度和时间均可影响黄精多糖聚集及降解。

2.4不同煮制条件对多花黄精多糖免疫刺激活性的影响

2.4.1不同煮制条件对RAW 264.7巨噬细胞活性的影响巨噬细胞在免疫应答中扮演重要角色，活化后的巨噬细胞能够吞噬外来病原体，分泌多种细胞因子，从而提高机体免疫能力[36]。受刺激后的巨噬细胞数量迅速增加，有利于细胞更快的吞噬外来物。因此，巨噬细胞的增殖率是免疫活性激活的指标[37-38]。由图3可见，与对照组相比，不同煮制条件，高浓度的多花黄精多糖均显著促进RAW 264.7细胞增殖，且效果与LPS组相当。说明多花黄精多糖能够有效促进免疫细胞增殖。但100 ℃煮制6 h和12 h后，其促进作用明显降低，尤其在低浓度下黄精多糖无显著促进细胞增殖作用，说明长时间煮制，对黄精多糖免疫刺激活性产生破坏作用。多糖浓度6.25、25、100 μg/mL均对细胞无毒性作用，因此后续实验以此浓度进行。

2.4.2不同煮制条件对RAW 264.7巨噬细胞NO分泌量的影响NO分泌量为巨噬细胞激活的重要参数，是机体免疫调节能力的关键指标[26， 38]。由图4可见，与对照组相比，短时间煮制下（2 h），不同煮制温度条件下的黄精多糖均具有显著刺激NO分泌的作用。但是，随着煮制时间延长，黄精多糖在刺激NO的作用逐渐下降。煮制温度加剧细胞NO分泌量的下降速度。60 ℃煮制下，12 h煮制可造成NO分泌能力显著下降。80 ℃条件下，6 h煮制则可使得NO分泌能力显著下降。虽然60 ℃及80 ℃长时间煮制导致NO分泌量下降，但仍然可显著刺激NO分泌，高于对照组。相比之下，高温100 ℃的长时间煮制（6 h及12 h）的黄精多糖在中低浓度下，无显著促进细胞分泌NO的作用。尤其是100 ℃煮制12 h获得的多糖在高浓度下，仍然无法刺激NO产生的活性。实验结果表明，100 ℃煮制超过6 h不利于黄精多糖激活巨噬细胞免疫活性。

3结论与讨论

煮制是黄精加工或者其多糖提取的重要步骤之一。研究发现，煮制温度与时间可改变多花黄精多糖的单糖质量比、分子量及其分布等，同时多糖结构的改变对其免疫刺激活性具有一定程度影响。煮制时间的延长对免疫刺激活性产生破坏，而温度的升高加剧破坏的速度。首先，低温60 ℃煮制条件下，多糖分子量随着时间延长呈现逐渐下降的趋势，但其单糖组成变化较小。其免疫刺激活性也随着时间增加而下降，因此，其免疫刺激活性的变化，可能与分子量的下降有关。然而，煮制温度提高至80 ℃时，分子量随着时间延长呈现逐渐下降趋势，同时，单糖组成中阿拉伯糖、半乳糖含量升高，葡萄糖、木糖降低。其免疫刺激活性显著下降可能与分子量及单糖组成的变化有关。因此，在中低温条件，随加工时间的延长，黄精多糖分子在一定程度上发生降解。但是，高温下黄精多糖分子发生聚集，而后随时间增加，多糖分子聚集体也降解。该结果与先前报道相似[2， 39-40]，经过煮制后的黄精多糖分子发生聚集，且黄精多糖在高溫下，免疫刺激活性显著下降，与其分子量不相关，可能与其单糖组成的变化紧密相关。高温更能促使黄精多糖中阿拉伯糖、半乳糖含量升高，葡萄糖、木糖降低，甚至长时间加热（12 h）可改变黄精多糖的主要单糖比例，同时可直接破坏黄精多糖原有的免疫刺激活性。研究表明，100 ℃煮制6 h及12 h会破坏多糖的免疫刺激活性。而现有黄精加工多采用“九蒸九制”，其蒸制温度通常为100 ℃，热加工时间多超过6 h，因而可能对多花黄精多糖免疫刺激活性造成一定破坏[6， 41]。

综上所述，加工温度和时间是保持黄精多糖免疫刺激活性的关键因素。为保留黄精多糖的活性，黄精加工及其多糖提取应适当控制温度与时间。本研究能够为后续研究黄精加工方式对其品质的影响提供初步的方法鉴别，并为不同加工方式的比较提供数据支持。参考文献

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Effect of Cooking on The Structure and Immunological Activities

in vitro of Polysaccharides from Polygonatum cyrtonemaWU Lan-lan WU Gang TAN Qiang-lai LIN Jin-feng GAN Shu-jiao XIONG Mei-hui WU Wei-jing

（1Xiamen Medical College， Xiamen 361023， China;

2Engineering Research Center of Natural Cosmeceuticals College of Fujian Province， Xiamen 361023，China;

3 Fujian Provincial Key Laboratory of Food Microbiology and Enzyme Engineering， Xiamen 361018， China）Abstract：ObjectiveCooking is one of the most commonly used methods for Polygonatum cyrtonema processing. This study explored the effect of different cooking temperature and time on the structure-activity relationship of Polygonatum cyrtonema polysaccharides to provide reference for its efficient use and precise control in processing. MethodPolygonatum cyrtonema polysaccharides were obtained by different cooking conditions. The functional group， monosaccharide composition， molecular weight and distribution of polysaccharides were analyzed by FT-IR ， ion exchange chromatography and GPC-MALLS . The mouse macrophage models were evaluated the effect of different cooking conditions on the immunological activities of Polygonatum cyrtonema polysaccharides， including cell viability and nitric oxide secretion. ResultThe increase of cooking temperature and time can increase the mass ratio of arabinose， galactose and galacturonic acid in Polygonatum cyrtonema polysaccharides， and decrease the mass ratio of glucose and xylose. Polygonatum cyrtonema had two polysaccharide peaks. Under medium and low temperature cooking conditions， their molecular weight decreased with the increase of cooking time. However， high temperature cooking can trigger the aggregation of Polygonatum cyrtonema polysaccharides before degradation. The results of NO secretion of RAW 264.7 macrophages showed that the increase of temperature and the prolongation of cooking time could destroy immunological activities of Polygonatum cyrtonema polysaccharides. ConclusionThe structure and immunological activities of Polygonatum cyrtonema polysaccharides were affected by cooking temperature and time. Therefore， in actual processing， excessive processing should be avoided to prevent reducing the efficacy of Polygonatum.

Keywords：Polygonatum cyrtonema; polysaccharides; cooking; structure; immunological activity