基于网络药理学方法研究知母治疗2型糖尿病作用机制

詹志敏，付万进，胡伟

作者单位：1合肥新桥国际机场有限公司急救站，安徽 合肥 230086；

2安徽医科大学第二附属医院药物临床试验研究中心，安徽 合肥 230022

随着社会经济的发展和人民生活质量的提高，T2DM 发病率呈逐年上升趋势，目前我国已成为全球糖尿病病人最多的国家。T2DM 为内分泌科常见疾病，以多饮、多食、多尿、消瘦和乏力为主要临床症状，可导致糖尿病肾病、视网膜病变、周围神经性病变、心脑血管疾病等并发症，严重危害人类健康，给社会、家庭带来巨大负担［1-2］。

中医认为T2DM 属于为“消渴症”范畴，其病机主要在于机体的阴虚燥热，以阴虚为本，燥热为标，中药治疗时基本原则以清热润燥、养阴生津为主［3-4］。中药知母为百合科植物知母的干燥后的根、茎，性苦、甘、寒，具有清热泻火、滋阴润燥之功，适用于高热烦渴，内热消渴，肠燥便秘之症，能有效降低T2DM 病人血糖水平，改善临床症状，疗效肯定［5-7］。但中药通过多成分、多靶点协同作用治疗疾病，使用现代药理学研究方法难以系统全面解析中药治疗疾病的作用机制［8］，目前知母治疗T2DM 的具体作用机制尚未明确，限制其进一步开发利用。

网络药理学是由药理学、生物信息学及计算机学的融合而发展起来的一门学科，主要通过大数据挖掘中药化学成分用于构建中药化学成分数据库；使用机器学习方法预测化合物和靶点之间作用关系；通过疾病相关数据库和文献的挖掘方法获得疾病相关靶点；将药物化学成分预测靶点与疾病靶点进行关联获得药物治疗疾病靶点；将上述信息抽象为网络关系模型后可以解释中药治疗疾病作用机制［9］。本研究利用网络药理在研究多成分和多靶点方面的优势，研究知母治疗T2DM 的主要机制，并为知母在临床应用提供证据，其研究方法流程见图1。

图1 基于网络药理学的方法研究知母治疗T2DM作用机制流程图

1 资料与方法

1.1 数据准备

1.1.1 知母化学成分数据库建立通过中药系统药理学数据库（TCMSP）挖掘中药知母中每个化学成分及其对应的化学性质参数，将得到的数据用于组建知母的化学成分数据库。

1.1.2 ADME 模型筛选知母活性分子体外ADME模型（吸收，分布，代谢和排泄）主要利用体外实验与数学建模方法研究药物在体内吸收代谢情况，该方法较以往基于动物实验方法研究药物体内吸收过程效率更高、成本更低，可用于大规模预测化学分子的药代动力学参数［10］。本次研究利用体外AD⁃ME 模型中的口服生物利用度（oralbioavailability，OB），半衰期（half-life，HL）和类药性（drug-like，DL）三个指标筛选知母中的潜在活性分子。OB 指药物经口服吸收后进入人体循环系统的能力，化合物OB指标值的大小与合物在体内吸收率呈正相关，本研究筛选了OB 指标值大于0.3 的化合物作为潜在的活性分子［11］。通过计算化学分子与已被批准上市药物结构之间的相似性来计算化学分子的类药性，DL 指标值大小与化合物成药可能性呈正比。DL 指标在药物的前期开发中促进高活性化合物筛中率，提高药物的开效率，本研究通过筛选化学分子的DL值大于0.18 作为潜在的活性分子［12］。半衰期指标化合物的血液浓度降低一半所需的时间，本研究筛选化合物半衰期指标值大于3 h 作为潜在的活性成分。

1.1.3 化合物作用靶点预测将ADME 模型筛选获的活性分子在TCMSP 数据库中挖掘其作用的靶点。该数据库通过随机森林和支持向量机（SVM）机器学习方法建模预测化合物作用靶点模型。随机森林和 SVM 模型性能对于化合物作用靶点预测具有较高的可靠性和鲁棒性，模型的平均准确率82.83%、召回率 81.33%、查准率 93.62%［13］。

1.1.4 疾病靶点挖掘在Uniprot、遗传关系数据库（GAD）和人类孟德尔遗传疾病数据库（OMIM）3 个人类疾病靶点数据库系统上使用“Diabetes mellitus type 2”和“Type 2 diabetes mellitus”2 个关键词、物种选择上使用“homo species”方法来挖掘与T2DM 相关的靶点，将获得靶点使用Venny 2.1系统取交集获得与T2DM相关的靶点集［14］。

1.1.5 T2DM 相关靶点蛋白相互作用（PPI）数据挖掘使用bisogenet 3.0 插件挖掘T2DM 中相关靶点蛋白之间相互作用关系，bisogenet 3.0插件通过整合6 个生物学数据库中的靶点间的作用关系，可较全面获得的疾病靶点的蛋白-蛋白相互作用数据［15］。本研究将bisogenet 3.0插件获得蛋白-蛋白作用关系使用Cytoscape 软件构建T2DM 靶点的蛋白-蛋白（PPI）相互作用网络，为更加简洁展示PPI 作用关系网络构建时删除无相互作用节点和节点自身相互作用的边和度值小于3的节点［16-17］。

1.2 富集分析将C-D网络中的蛋白靶点导入DA⁃VID 6.8 系统中，使用Fisher 精确检验方法进行KEGG 通路富集分析，排除与T2DM 疾病不相关通路，筛选出P<0.01 的通路进行分析，并构建C-D-M网络。

1.3 网络构建本研究使用Cytoscape 3.6.0 软构建了以下4 种网络：T2DM 疾病靶点蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络、药物分子-靶点（C-T）网络、药物分子-疾病靶点（C-D）网络和药物分子-疾病靶点-通路（CD-M）网络。

1.4 分子对接在中药系统药理学数据库中下载格式为“.mol2”化合物对应分子结构，使用Discovery Studio 软件对化合物结构进行优化，使用AutoDock软件中prepare_ligand4脚本将“.mol2”格式分子转化为“.pbdqt”格式文件。

在Uniport 中检索GSK-3β 蛋白结构，并下载“PDB”格式的蛋白分子，使用Discovery Studio 软件去除蛋白中的水分子和配体化合物，再使用Discov⁃ery Studio 软件对蛋白分子进行结构优化，使用AutoDock 软件中prepare_receptor4 脚本将“PDB”蛋白结构加氢并转化为“.pdbqt”格式文件，最后使用AutoDock 软件对蛋白对接盒子的空间坐标进行确定。

使用AutoDock Vina 软件将处理好的小分子与蛋白文件进行批量分子对接。每个小分子化合物与蛋白对接后产生20个构象，本次研究选择能量最低的构象进行展示，其中蛋白与分子相互作用的三维结构使用Pymol 软件制作，二维结构图使用Dis⁃covery Studio软件制作。

2 结果

2.1 药物化合物-靶点网络分析

2.1.1 知母成分数据库构建知母通过数据库挖掘获得81 个化学分子，将81 个分子的化学性质参数信息用于构建知母成分数据库。知母化学成分数据库中的化学分子根据成分性质可分为双苯吡酮类、皂苷类、甾醇类、木质素类、生物碱、多糖类化合物。

2.1.2 ADME 筛选活性分子使用ADME 模型指标筛选活性分子，其中OB 指标筛选出28种化学分子，半衰期指标筛选出27 个化合物，DL 指标值筛选出48种化学分子，筛选结果见图2，对ADME 模型各个指标筛选活性分子使用Venny 2.1 系统取交集得到15个活性分子，知母活性化合物详细信息见表1。

图2 ADME活性分子筛选

表1 知母活性成分筛选结果

2.1.3 知母药物化合物和靶点网络知母活性分子作用靶点（C-T）网络一共包括129 个节点和250个边，见图3。该网络由15 个活性分子节点和114个蛋白靶点节点组成，其中活性分子节点与靶点节点间有250 个作用关系。不同节点在C-T 网络的重要程度并不相同，不同的化学分子作用靶点数量并不均衡，如山奈酚分子作用72 个潜在靶点，分子豆甾醇作用43 个靶点，而淫羊藿苷Ⅰ、菊花黄素和知母皂苷E_qt 其仅影响1 个蛋白靶点。同样的，一些蛋白靶点可被多种化合物协同作用，一些靶点仅受很少化合物的作用。例如，ERS1 靶标被12 种化合物调节，知母中11种化学分子调节AR蛋白靶点，但是一些靶点如TP3、TNF 靶点仅受一个分子的调节。知母C-T网络不同节点重要程度不相同说明知母在治疗T2DM可能由关键化合物起重要作用。

图3 知母活性分子作用靶点网络：绿色圆形表示靶点，黄色三角形表示知母活性分子

2.2 T2DM 相关的靶点挖掘本研究从Uniprot 中获得288 个、从OMIM 获得183 个、从GAD 获得356个与T2DM 相关靶点蛋白，将上述结果取交集获得730个T2DM相关靶点蛋白，结果见图4。

图4 T2DM相关的靶点蛋白

2.3 T2DM 蛋白质-蛋白质相互作用网络将730个T2DM 相关的靶点蛋白置入bisogenet 3.0 插件中获得蛋白之间相互作用数据后，删除网络中没有相互作用节点和自相作用节点的边，再使用Cytoscape软件重新构建T2DM靶点蛋白PPI网络，并删除度值小于3 的节点，结果见图5，该网络由230 个节点和777 作用关系构成。PPI 网络图中节点“度值”越大说明节点在网络中与其他节点连接程度越高，在T2DM 的PPI 网络中NTRK1、TP53、ESR1、ATK1、STAT3、SMAD3靶点的“度值”较高，对应的度分别为78、44、32、30、26、24，说明这些靶点在网络中重要程度越高，这些靶点在T2DM 的发展中可能起重要作用。

图5 T2DM相关的靶点PPI网络

2.4 知母-T2DM 靶点网络使用Cytoscape 软件中的Merge 工具对知母C-T 网络、T2DM 的PPI 网络取交集，获得知母分子-T2DM 靶点（C-D）网络。知母-T2DM 靶点网络中分子作用靶点详细信息见表2。该网络由33 个节点和76 个边构成，其中含有13 个知母活性分子，20个T2DM靶点蛋白，见图6。

图6 知母活性分子-T2DM靶点网络

表2 知母-T2DM靶点网络中分子作用靶点详细信息

2.5 知母活性分子作用T2DM 靶点-通路网络为研究知母治疗T2DM 主要作用通路，本研究将知母活C-D网络中的T2DM 靶点蛋白置入DAVID 数据库中进行KEGG 富集分析，将富集结果中特殊疾病信号通路删除，保留P值最小10 个通路，再利用Cyto⁃scape 软件将上述结果构建知母活性分子-T2DM 靶点-通路（C-D-M）网络，结果见图7和图8。C-D-M 网络由43个节点和133个边组成，该网络包含13个知母中的化合物和20个T2DM靶点和10个通路。

图7 知母活性分子-T2DM靶点-通路网络图

图8 知母活性分子-T2DM靶点-通路气泡图

从C-D-M 网络可知母中活性分子作用的8 个蛋白靶点富集到胰岛素抵抗通路，7 个蛋白靶点富集到PI3K-Akt 信号通路，6 个蛋白靶点富集到流体剪切应力和动脉粥样硬化、糖尿病性心肌病和胰岛素信号通路，5 个蛋白靶点富集到AGE-RAGE 信号通路在糖尿病并发症中的作用、HIF-1 信号通路、AMPK信号通路和甲状腺激素信号通路，4个蛋白靶点富集到2型糖尿病通路上，详细信息见表3。

表3 知母治疗T2DM富集通路信息

2.6 分子对接结果使用AutoDock Vina 分子对接结果提示MOL000631、MOL000422、MOL004373、MOL004497 与糖原合成酶激酶（GSK-3β）有明显相互 作 用 关 系 ， MOL000631、 MOL000422、MOL004373、MOL004497 与GSK-3β 对接后最稳定构象的能量分别为−8.3、−7.3、−8.0 和−7.6 kcal/mol，结果见表4。

由分子对接的三维结构图可知，对接后MOL000631、MOL000422、MOL004373、MOL004497分子最稳定的构象在GSK-3β 表面空隙或表面沟壑空隙中。由分子对接二维结构图可知，MOL000631分子可以与GSK-3β 第338 位丝氨酸残基产生一个氢键；MOL000422分子可以与GSK-3β第336位丙氨酸残基产生一个氢键；MOL004373分子可以与GSK-3β 第341 位天冬氨酸残基产生一个氢键相互作用；MOL004497分子可以与GSK-3β第89位谷氨酰胺残基、第94 位的赖氨酸残基、第95 位的天冬酰胺残基和第96位精氨酸残基分别产生一个氢键相互作用，见图9。

图9 知母活性分子与糖原合成酶激酶对接后对接结构图

3 讨论

糖尿病以高血糖为特征的代谢性疾病，长期高血糖可导致机体的心血管、消化、神经等组织出现并发症，其发病机制与胰岛素通路、免疫反应、抗炎反应氧化应激等反应有关［18-19］。本研究发现知母通过多成分、多靶、多通路协同效应用于T2DM治疗。

在C-D 网络中有13 个知母分子调控20 个T2DM 疾病相关靶点来用于糖尿病的治疗。其中糖原合成酶激酶（GSK-3β）在C-D网络的可被4个知母活性分子调节。GSK-3β 酶在肝脏的葡萄糖代谢中起着重要作用，GSK-3β可通过磷酸化糖原合成酶可抑制其酶活性，抑制肝脏糖原的合成，使机体的血糖升高，在糖尿病病人体内GSK-3β 表达量较正常人高30%、其酶的活性高一倍［20］，分子对接提示4 个知母活性分子可与GSK-3β 产生氢键相互作用。糖尿病血管病变是糖尿病导致后遗症产生的主要原因，血管病变与机体炎症的氧化应激有着密切关系，体内一氧化氮（NO）可以明显降低体内的炎症、氧化应激反应。内皮型一氧化氮合成酶（NOS3）作用底物是精氨酸，可将精氨酸转化为瓜氨酸或者是N-羟基精氨酸，并进一步代谢合成NO，NO促进葡萄糖转运至细胞内；NO 也可减缓胰岛β 细胞损伤，保护胰岛β细胞功能，加速细胞对葡萄糖的摄取，促进细胞内的脂代谢增强，研究发现糖尿病病人体内NO 含量较正常人组明显降低［21-22］，本研究发现知母活性分子可以调节NOS3信号通路。

通过分析C-D-M 网络发现，知母可通过调节8个靶点调控胰岛素抵抗通路，胰岛素抵抗是指靶细胞对胰岛素的代谢反应降低、或在整个机体水平上、循环或注射胰岛素对血糖的降低作用受损。机体主要在外周组织（肌肉和脂肪）和肝脏组织出现胰岛素抵抗。体内胰岛素在外周组织可促进葡萄糖吸收或储存，在肝脏组织抑制肝脏的葡萄糖输出从而达到降低血糖的水平，胰岛素抵抗是导致机体出现糖尿病主要原因［23］。

PI3K/AKT信号通路不但在细胞的分裂、分化和凋亡中起着重要的作用，也在糖类合成转运和代谢、蛋白质合成以及脂肪代谢途径起着重要作用［24］。知母活性分子通过调控7 个靶点作用于PI3K/AKT 信号通路。胰岛素作用于细胞膜表面的胰岛素受体后主要通PI3K/AKT 通路及MAPK 通路发挥功能、其中，PI3K/AKT 通路在控制体内营养平衡和器官存活方面起着重要的作。胰岛素在PI3K/AKT 通路中通过上调PI3K 和Akt 分子水平，启动PI3K-Akt 信号通路的传导，活化的下游分子增加细胞内糖原的生成，抑制糖异生反应，最终起着降低机体血糖水平［25］。

AMPK 信号通路是生物能量代谢调节的关键通路，在调节机体能量代谢、调控细胞内能量平衡方面起着重要作用［26］。知母活性分子通过调控5个靶点作用于AMPK 信号通路。AMPK 蛋白可通过调控下游多个效应因子影响糖类代谢以及氧化应激反应等多种生理过程，保护胰岛β细胞，抑制胰岛素抵抗的发生，从而用于T2DM疾病的治疗［27］。

HIF-1 信号主要参与细胞对氧含量的变化的反应，尤其是对氧气的减少或缺氧作出反应，激活HIF-1 信号可促红细胞生成、葡萄糖转运、糖酵解酶、血管内皮生长因子和其他基因蛋白物质增加氧的输送或促进缺氧能量代谢［28］。本研究发现知母活性分子调控5个蛋白靶点作用于HIF-1信号通路。长期血糖升高导致糖化血红蛋白在红细胞中的上升、红细胞携氧量下降，导致机体细胞处于缺氧环境，而低氧环境可激活HIF-1 信号促进40 多种蛋白表达增加机体对缺氧环境适应性。但长期血糖水平升高会降低HIF-1α蛋白表达，导致机体缺氧对缺氧适应性降低；严重持续缺氧可导致HIF-1α表达水平下降，HIF-1α 表达水平下降是高血糖导致组织发生周围神经病变及糖尿病疾病进展的重要因素［29］。

从C-D-M 网络中通路节点发现知母也可通过流体剪切应力和动脉粥样硬化、糖尿病性心肌病和胰岛素信号通路、AGE-RAGE 信号通路及甲状腺激素信号等通路上用于T2DM治疗。

4 结论

综上所述，本研究通过使用网络药理学方法研究知母治疗T2DM 作用机制，对中药药理作用机制的探索提供了一定的参考价值，提示知母中的活性分子可通过调节调控胰岛素通路、胰岛素抵抗通路、PI3K-Akt 信号、调控NO 合成，调控缺氧信号通路、调控能量代谢等途径用于T2DM 的治疗，揭示了知母治疗T2DM 的临床治疗潜力。但是，本研究主要利用生物信息学数据库信息和算法对知母对T2DM 作用机制进行预测研究，研究过程中尚未考虑到药物质量、剂量、剂型等因素的影响，因此后期还需采用体内试验研究方法逐步验证预测结果可靠性。

（本文图1~5见插图8-5，图6~9见插图8-6）