基于网络药理学与实验验证探讨肺岩宁方治疗非小细胞肺癌机制

桑舒柳，丁蓉珍，姜靖洁，龚亚斌

作者单位：上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院肿瘤科，上海 200437

据统计，目前肺癌的死亡率仍居首位，是癌症死亡的主要原因［1］。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer， NSCLC）约占肺癌总发病率的85%［2］。肺癌治疗方法包括手术、放化疗、靶向、免疫等［3-4］，但病人预后欠佳。据调查显示约40%的NSCLC 病人存在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）突变［5］，靶向治疗在临床应用越来越广泛，但病人仍出现明显的不良反应。多项研究已证实中医药在恶性肿瘤的治疗中应用广泛，可增效减毒，提高病人生存质量、延长生存期等［6］。肺岩宁方是上海市名中医徐振晔教授总结多年临床实践而研发出来的抗癌经验方，由生黄芪、黄精、石见穿、七叶一枝花等组成，具有益气养精，解毒散结之功［7］。临床研究表明肺岩宁方能有效抑制晚期肺癌的侵袭和转移［8］，并能有效提高NSCLC 病人的生存质量［9］，但肺岩宁方治疗EGFR 突变型NSCLC 的具体分子机制仍未阐明。本研究于2020 年 11 月至2021 年 2 月以网络药理学为切入点，预测肺岩宁方治疗EGFR 突变型NSCLC 的主要活性成分、作用靶点及作用通路，并通过细胞实验进行生物学验证，探讨肺岩宁方治疗EGFR突变型NSCLC的潜在作用机制，为其临床上更广泛应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 化合物有效成分和靶点的收集及疾病靶点的预测以“白术”“蜂房”“干蟾皮”“黄精”“黄芪”“灵芝”“山慈菇”“石见穿”“淫羊藿”“重楼”“山茱萸”为检索词，在TCMSP 数据库（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中检索11 味药的化学成分，根据药物动力学（ADME），以生物利用度（OB）≥30%，类药性（DL）≥0.18为限制条件。查阅文献后对TCMSP中未预测到的有效化合物成分进行补充。在Pubchem提取相应化学成分对应的smile 号，并通过Swiss Tar⁃get Prediction收集对应的靶点。

将关键词设置为“non-small cell lung cancer”，检索Genecard（www.genecards.org）和DisGeNET（www.disgenet.org）数据库，选择“Homo sapiens”，检索NSCLC 的疾病靶点。然后将药物靶点与疾病相关靶点取并集，得到韦恩图，并集得到的靶点则为肺岩宁方治疗NSCLC的潜在靶点。

1.2 肺岩宁方活性成分-靶点网络和蛋白质相互作用网络（PPI）构建将上述获得的活性成分及靶点对应关系导入到软件Cytoscape 3.7.2 中进行相关的网络构建和分析，画出肺岩宁方“活性成分-靶点网络”图，采用“Network Analyze”插件进行网络特征分析来筛选重要的活性成分。

将肺岩宁方与NSCLC 的并集靶点导入STRING（https：//string-db.org） 平台，选择“Homo sapiens”，筛选条件为置信度>0.7，下载蛋白互作文件后将其导入到Cytoscape 3.7.2 中，生成PPI 网络图，以“De⁃gree”“BetweennessCentrality”和“ClosenessCentrality”超过中位数的值来筛选出重要靶点。

1.3 基因富集分析和化合物-靶点-通路图的构建将1.2 的重要靶点导入Metascape（http：//metascape.org/）平台，选择“Homo sapiens”， 进行GO 和 KEGG富集分析。用Cytoscape画出肺岩宁方化合物-靶点-通路关系图。

1.4 肺岩宁方抗非小细胞肺癌核心靶点的筛选将“1.2”筛选的靶点导入GEPIA 数据库，选择“总体生存”，P<0.05 和P（HR）<0.05 作为LUAD 数据集的显著性阈值，筛选出肺岩宁方治疗NSCLC 的核心靶点。

1.5 细胞培养EGFR 突变型肺癌细胞株HCC827购于中国科学院上海细胞库，用含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的RPMI 1640 培养基培养细胞，置于37 ℃、二氧化碳体积分数为5%的饱和湿度培养箱中。将肺岩宁方干燥成冻干粉后保存于−20 ℃冰箱中。按照实验要求将肺岩宁方冻干粉溶解于培养基中稀释成所需浓度，用0.22µm滤器过滤后现配现用。

1.6 CCK8 实验HCC827 细胞用不同浓度（0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 g/L）的RPMI-1640 培养基培养在96 孔板中，对照组则为不含肺岩宁方的培养基，密度为3×103个/孔。肺岩宁方干预48 h后在每板内加入CCK-8 试剂（每孔10 µL），随后放置培养箱中继续培养2 h，测定每孔的吸光度（OD）值，波长设置为450 nm，计算细胞抑制率和IC50值。

1.7 平板克隆形成实验将HCC827 细胞以1 000个/孔的密度接种于六孔板孔内，用含30%FBS 的培养基，用不同浓度的肺岩宁方干预细胞，2 周后弃培养基，用PBS 清洗后用多聚甲醇固定30 min，加入0.1%结晶紫溶液染色，30 min 后流水冲洗，晾干拍照。

1.8 细胞侵袭实验将HCC827细胞消化计数重悬至2×104个/孔，先加入100 U Matrigel 胶，再吸取细胞悬液，同时加入不同浓度的肺岩宁方到上室，下室加入500 µL 含15% FBS 的培养基后将24 孔板置于培养箱，24 h 将Transwell 小室取出，弃培养基，用PBS 轻微冲洗2 次，甲醛固定30 min 后加入 0.1%结晶紫溶液染色，30 min后用PBS清洗，晾干即可于倒置显微镜下拍照。

1.9 qRT-PCR 实验用trizol 试剂提取HCC827 细胞中总RNA。然后用反转录试剂盒将RNA 反转录成cDNA，根据生产厂家的说明书采用RT-qPCR 芯片分析基因表达谱。采用2−ΔΔCt计算法测定mRNA表达水平，以GAPDH作为内参。

1.10 统计学方法所有细胞实验重复3 次。统计作图采用GraphPad 软件。数据以表示，两组独立样本资料采用t检验，多组间统计用单因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 活性成分及治疗靶点结合已有文献报道和TCMSP 数据库筛选出有效成分白术8 种，蜂房6 种，干蟾皮10 种，黄精13 种，黄芪13 种，灵芝42 种，山慈菇7 种，石见穿7 种，淫羊藿16 种，重楼11 种。取P>0，将所有化合物对应靶点去掉重复后得到靶点共904 个。GenCards 等数据库收集到NSCLC 疾病靶点共3 813 个，我们将肺岩宁方和疾病靶点取并集得到521 个靶点，即肺岩宁方治疗NSCLC 的潜在靶点。见图1。

图1 肺岩宁方与NSCLC交叉靶点的韦恩图

2.2 活性成分-疾病-靶点网络和PPI 网络构建构建活性成分-靶点网络，该网络由972 个节点构成，包括7 637 条边，其中单个靶点的度值（degree）决定所连接靶点的数量，见图2。

图2 肺岩宁方成分潜在治疗靶点网络图

将521个靶点导入STRING平台，以置信度>0.7为条件进行筛选后导入 Cytoscape 3.7.2生成PPI网络。进行网络拓扑参数分析，以“Degree”大于中位数（51）、“BetweennessCentrality”大于中位数（0.009 325 23）和“ClosenessCentrality”大于中位数（0.454 049 14）为条件共筛选出重要靶点共71个。见图3。

图3 肺岩宁方NSCLC潜在治疗靶点PPI网络图

2.3 GO 和KEGG 富集分析将71 个重要靶点导入Metascape 平台，分析GO 和KEGG 富集情况。GO分析取P值前20，其中生物过程主要包括细胞迁移、正向调节转移酶活性等，细胞组成主要包括膜筏、膜微区、胞质核周区等，分子功能主要包括蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性磷酸转移酶活性等。KEGG 富集分析显示肺岩宁方抗NSCLC 的信号通路主要有PI3K-AKT 信号通路、癌症相关信号通路HIF-1信号通路等。见图4。

图4 肺岩宁方治疗NSCLC潜在靶点的GO和KEGG富集分析

2.4 肺岩宁方成分-NSCLC 治疗靶点-通路网络图的构建利用Cytoscape 建立肺岩宁方治疗NSCLC的活性成分-靶点-通路网络。网络由219 个节点和1 579条边组成（图5）。

2.5 肺岩宁方核心靶点分析在GEPIA 数据库中搜索71 个重要靶点，通过总体生存率筛选出了14个核心靶点（表1）。

2.6 肺岩宁方具有抑制HCC827 细胞增殖的作用CCK8 结果显示，用不同浓度的肺岩宁方（0~1 g/L）干预HCC827 细胞48 h，肺岩宁方能显著降低细胞HCC827 细胞的增殖能力，并呈剂量依赖性。IC50值约为700 mg/L。见表2。

表2 用CCK8法检测肺岩宁方（0~1 000 mg/L）作用48 h后的HCC827细胞的抑制率/（%，）

注：①与0 mg/L相比，P<0.01。②与对照组相比，P<0.001。

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2.7 肺岩宁方具有抑制HCC827 细胞集落形成的作用克隆形成实验结果如图6 所示，与对照组相比，肺岩宁方干预14 d 后，HCC827 细胞的克隆形成数量明显降低，且呈浓度依赖性，说明肺岩宁方具有抑制HCC827细胞集落形成的作用。见表3。

图6 肺岩宁方对HCC827细胞克隆形成的影响）

表3 肺岩宁方对HCC827细胞克隆形成的影响/（%，）

表3 肺岩宁方对HCC827细胞克隆形成的影响/（%，）

注：①与对照组相比，P=0.015。

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2.8 肺岩宁方具有抑制HCC827 细胞侵袭能力的作用侵袭结果显示，与对照组相比，肺岩宁方干预24 h 后，HCC827 细胞的侵袭能力受到明显抑制（P<0.001），说明肺岩宁方具有抑制肺癌细胞的侵袭能力。见图7，表4。

图7 肺岩宁方对HCC827细胞侵袭能力的影响

表 4 肺岩宁方对HCC827细胞侵袭能力的影响/（%，）

表 4 肺岩宁方对HCC827细胞侵袭能力的影响/（%，）

注：①与对照组相比，P<0.01。②与对照组相比，P<0.001。

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2.9 肺岩宁方核心靶点mRNA 的验证为了验证肺岩宁方对网络药理学筛选的14 个核心靶点mRNA 水平的影响，用IC50的浓度干预HCC827 细胞48 h 后，采用RT-qPCR 芯片进行检测。结果显示肺岩宁方能抑制HCC827 细胞中KIT 的mRNA 表达（P<0.01）。见图8，表5。

图8 对照组和肺岩宁方组14个核心靶点的mRNA表达热图

表 5 干细胞生长因子受体KIT mRNA的表达/

表 5 干细胞生长因子受体KIT mRNA的表达/

注：①与对照组相比，P<0.05。

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3 讨论

中药方剂的化合物成分复杂，目前研究仍未完全阐明其分子机制。网络药理学是一种生物信息分析工具，被广泛用于研究中药方剂的活性成分及潜在作用靶点，为其作用机制提供依据［10-11］。近年来有研究发现肺岩宁方能下调CXCLs/CXCR2 轴抑制肿瘤微环境中性粒细胞浸润从而预防肺癌转移［12］。此外，肺岩宁方可以促进代谢和改变线粒体膜电位来诱导肺腺癌细胞凋亡［13］。为了进一步研究肺岩宁方抗NSCLC 的分子机制，本研究采用网络药理学的方法挖掘肺岩宁方的活性成分，探索肺岩宁方化合物对应的靶点与NSCLC 疾病靶点的关联，并根据筛选出的核心靶点进行实验验证。

首先，通过ADME 筛选，从肺岩宁方11 味药中鉴定出了133个活性成分，主要包括槲皮素、白藜芦醇、黄芩素等。已有研究［14-15］证实，肺岩宁方中多个活性成分可以抗肿瘤，比如槲皮素（SCG5、YYH14、CL1、SJC2、HQ13）是一种黄酮类化合物，存在于山慈菇、淫羊藿、重楼、石见穿、黄芪中，可通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭以及抑制肿瘤血管生成、促进细胞凋亡和介导细胞自噬等多条途径发挥抗肿瘤作用。黄芩素（HJ1）来源于黄精，是一种生物类黄酮，在不同癌细胞中均具有抗肿瘤作用［16］，并能抑制EMT 通过PI3K/Akt/NF-kB 途径使肺腺癌细胞抗凋亡从而提高肺腺癌细胞对顺铂的敏感性［17］。白藜芦醇（SJC5）来源于石见穿，是一种天然的多萜类化合物，可作为癌细胞凋亡的增强剂［18］，可通过抑制细胞周期和诱导细胞凋亡来抑制乳腺癌细胞的增殖［19］。因此，肺岩宁方抗NSCLC 的机制可能与多个化合物协同作用有关。

然后，本研究对肺岩宁方的化合物成分对应的重要靶点进行进一步分析和实验验证。通过PPI网络和生存分析筛选出14 个靶点，PCR array 结果显示肺岩宁方能抑制HCC827 细胞KIT 基因的mRNA水平。KIT 是一种干细胞生长因子受体，也被称为原癌基因c-KIT 或CD117，是一种受体酪氨酸激酶。据研究［20］，KIT 是经典的肿瘤干细胞（tumor stem cells，TSCs）标志分子，参与新生血管形成。此外，KIT 基因在肺癌和其他小细胞癌，胸腺癌以及卵巢癌等多种肿瘤中过表达［21］，同时也是预测NSCLC 预后不佳的潜在标志物［22-24］。我们发现KIT 基因直接靶向肺岩宁方中华蟾素（GCP4）、华蟾素毒精（GCP3）、黄芩素（HJ1）、薯蓣皂素（HJ4）、白藜芦醇（SJC5）等化合物。研究发现白藜芦醇可以激活Sirt1 来下调c-kit/SCF，影响慢性前列腺炎进展中平滑肌癌的发展［25］。因此，肺岩宁方可能是通过KIT下调达到抗肿瘤的目的。

最后，本研究通过中药-化合物-靶点通路的关系探索肺岩宁方治疗NSCLC的潜在机制。KEGG结果显示肺岩宁方治疗NSCLC 主要涉及多种癌症相关信号通路、PI3K-AKT 信号通路、HIF-1 信号通路等信号通路。据报道，PI3K/Akt 信号通路是重要的癌症通路，可以促进癌细胞生长［26］，在某些癌症的发生发展过程中易发生异常激活［27］，其中最广泛的两种机制是由受体酪氨酸激酶和信号通路中特定元素的体细胞突变触发［28］。研究［29-30］显示，PI3KAkt 信号通路在抑制肺癌细胞增殖和促凋亡中起着重要作用。PI3K 活性受多种癌基因和生长因子受体的调控，其信号升高常被认为是癌症发生的标志［31］。本研究发现KIT 基因是PI3K-AKT 通路的关键分子。研究［32］表明KIT 能与干细胞生长因子（SCF） 结合激活下游PI3K-AKT 通路信号。因此，肺岩宁方可能是通过下调KIT 从而抑制PI3K-AKT 信号通路来达到抗NSCLC 的目的。但本研究未进一步进行机制验证和动物实验，这也是本研究下一步研究的方向。

综上所述，本研究采用了网络药理学来探索肺岩宁方治疗NSCLC的药物成分-靶点-疾病的相互作用。肺岩宁方可能通过下调KIT 基因调控PI3KAKT 信号通路来发挥抗癌的作用，这为临床研究中肺岩宁方治疗NSCLC 提供了科学依据，也为探索肺岩宁方抗NSCLC的作用机制提供了新的方向。

（本文图1，2见插图8-3，图3~8见插图8-4）