用“扫雷游戏”原理标识新型冠状病毒核酸检测中的可能交叉污染孔*

张海龙,牟小会,王 萍,滕 敏

贵州省安顺市人民医院医学检验科,贵州安顺 561000

新型冠状病毒核酸检测既是确诊新型冠状病毒感染病例和无症状感染者的实验室依据,也是疫情处置措施判定的重要标准[1-2]。有研究在各机构实验室开展新型冠状病毒核酸检测过程中发现,由阳性标本、质控品及扩增产物造成的实验室环境污染、标本污染易导致假阳性的检测结果,从而造成防控措施过度、人员恐慌及对核酸检测结果不可信等问题[3-5]。

针对因人员操作不当、质控品管理不到位等原因造成的阳性标本、质控品及扩增产物污染可通过加强操作人员培训、规范质控品管理、实施实验室风险评估及管理等方式来避免假阳性结果的出现[6-7]。而在加样和核酸提取过程中,因移液吸头外壁携带污染以及核酸提取仪高速震荡形成的气溶胶污染引起的假阳性则很难避免[6,8-9]。这种情况通常发生在相邻孔为强阳性标本或质控品时,会造成初筛结果为阳性而复检结果为阴性,从而需要进行复检或重新采样检测[10],很大程度上增加了检测工作量。

为快速、直观地显示初筛结果中可能为孔间交叉污染的孔位,便于及时复检,同时减少不必要的第2次复检。本研究基于“扫雷游戏”模式,根据聚合酶链反应(PCR)扩增原理设置判断规则,用Excel表格模拟设计PCR反应板,直观显示实时检测结果及可能存在污染的孔位,以方便后续复检及结果判断。

1 资料与方法

1.1一般资料 从上海宏石实时荧光定量PCR仪中导出2022年11月29日隔离点送检的、检测编号为027B检测板的新型冠状病毒核酸检测原始数据,共计90例标本、3个阴性对照、2个空白对照及1个弱阳性对照的检测结果。

1.2方法

1.2.1检测规则 新型冠状病毒核酸检测的初筛试剂选用上海思路迪生物医学科技有限公司试剂;第1次和(或)第2次复检则采用“初筛试剂+湖南圣湘生物科技有限公司试剂”的双试剂复检模式。

1.2.2基于“扫雷游戏”的评估规则 12×8的核酸提取深孔板,除周边及四角孔位的相邻孔位较少(3～5个)外,其余孔位均可能受到周边8个孔位的加样携带污染和提取仪震荡带来的气溶胶污染。因此,如果该孔位检测结果为阳性,则可能是源于周边8个孔位中强阳性标本的污染。

1.2.3被污染孔的循环数(Ct)值-污染源孔Ct值≥5的标准设定 按照PCR扩增原理,当扩增效率为100%时,检测结果间相差n个Ct值即代表标本待测模板间存在2n倍差异。为了最大限度地标识出可能被污染的孔位,假设加样200 μL的标本可能导致相邻孔位累计最大量6.25 μL的携带污染或气溶胶污染。此时,阴性标本可能被污染,其病毒含量约为污染源孔的1/32[6.25/(200.00-6.25)],则被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值=5。因此,为找出所有可能被相邻孔污染的孔位,可设定“被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值≥5”的条件来识别被污染孔。

1.2.4Excel2021直观标识可能被污染孔位 用Excel2021模拟设计2块PCR反应板(孔位号按照逐列排序的方式赋号),其中1块从原始数据中提取ORF1ab及N基因两个靶标的检测值,并按照扩增区12×8的模式对应显示反应孔的Ct值(2个靶标均无Ct值时不显示)。另一块板的每个单元格输入函数“IF(AND(MIN(OFFSET(Sheet4!B3,-1,-1,3,3))<=41,MIN(OFFSET(Sheet4!B14,-1,-1,3,3))<=41,Sheet4!B3-MIN(OFFSET(Sheet4!B3,-1,-1,3,3))>5,Sheet4!B14-MIN(OFFSET(Sheet4!B14,-1,-1,3,3))>5,Sheet4!B3<=41,Sheet4!B14<=41,OR(Sheet4!B3<>41,Sheet4!B14<>41)),(ROW()-2)+(COLUMN()-16)*8&"号位可能污染","")”,调用Sheet4中各反应孔的ORF1ab和N基因的检测值进行运算:当该孔位检测为阳性(即ORF1ab或N基因有Ct值)时,分别用该孔的ORF1ab和N基因的Ct值减去周边8个相邻孔位中ORF1ab和N基因最小的Ct值,当两个计算结果均≥5时,标识该孔位可能被污染。为方便计算,无Ct值的靶标默认其Ct值为最大扩增Ct(41)。见图1。

注:A用于显示各反应孔ORF1ab和N基因的Ct值;B用于显示可能污染的孔位基因;O代表ORF1ab基因;N代表N基因;0表示还未统计Ct值。

1.2.5测试表格的适用性 选取强阳性结果多、易出现孔间污染的隔离点标本的核酸检测结果,输入表格,对表格中显示为可能污染的标本进行双试剂复核及2次复核,评估表格的适用性。

2 结 果

2.1设计表格可直观显示扩增结果及标识可能被污染的孔位 输入隔离点027B检测板的新型冠状病毒核酸检测数据,图2A在相应孔位显示了阳性孔的ORF1ab和N基因的Ct值,同时图2B标识B11为“82号位可能污染”。分析可知,B11孔可能源于A12孔污染,B11孔与A12孔两个靶标的Ct值差值为ORF1ab基因7.36(26.14-18.78)、N基因7.39(23.22-15.83),Ct值差值均>5,因此B11孔可能被污染;D2孔与E3孔相邻,但其ORF1ab基因的Ct值差值为0.62(30.77-30.15)、N基因的Ct值差值为2.93(29.15-26.22),均<5,因此排除污染的可能。见图2。

注:A为检测板中所有阳性孔位的ORF1ab和N基因的Ct值;B为检测板中被判为可能污染的孔位。

2.2初筛阳性孔2次新型冠状病毒核酸复检证实表格的适用性 对027B检测板上所有初筛为阳性的标本进行双试剂第1次和第2次复检,结果显示,B11孔位2次复检结果均为阴性,D2孔位2次复检均为阳性,证明该表格适用于实际工作中新型冠状病毒核酸检测的结果分析,能快速、直观地显示可能存在的污染孔位。见表1。

表1 隔离点标本027B检测板初筛阳性孔2次复检结果(Ct值)

3 讨 论

目前,医疗机构临床实验室开展新型冠状病毒核酸检测所采用的方法以反转录实时荧光定量PCR法为主[11],但该方法对加样环境和检验人员要求较高,且容易造成孔间交叉污染,导致假阳性检测结果[12]。由于孔间交叉污染多源于加样和核酸提取过程中的携带污染和气溶胶污染[13-14],具有偶发性,很难通过实验室质量控制和风险管理进行规避,只能通过实时分析检测结果和多次复检进行评判。

本研究通过Excel软件模拟设计PCR反应板的布局,直观地显示各反应孔与其相邻孔位的位置关系,并设置“当阳性孔与其周边最强阳性孔的双靶标Ct值相差≥5时,判定该孔为可能污染”的标准,可准确地标识可能存在污染的孔位。

当下,由于全国各地疫情防控政策的优化,陆续取消了大规模、集中化的社会面核酸筛查,检测机构减少可能引起医疗机构实验室未来一段时间内检出率的增加。结合该表格的使用,检验人员可快速找出可能为交叉污染的标本、及时进行复检。一方面减少了2次复检的程序,缩短报告发放时间;另一方面避免了假阳性结果的发出。此外,针对定点治疗医院或方舱医院等阳性标本较集中的机构,当初检、复检结果不一致时,会启动2次复检的流程[10],极大地增加了检测的工作量。此时,将该表格用于分析各阳性孔是否被污染,可以避免非必要的2次复检,减少核酸检测工作量。

本研究判定污染的标准为“被污染孔的Ct值-污染源孔Ct值≥5”,是基于检测试剂盒扩增效率为100%、200 μL加样量可能携带或造成相邻孔累计6.25 μL污染的假设。实际工作中,很多新型冠状病毒核酸检测试剂盒的扩增效率≤90%[15],吸头携带或气溶胶污染量可能低于6.25 μL,因此,Ct值差值≥5的标准可根据各实验室检测对象、检出率等因素进行适当调整。

综上所述,基于“扫雷游戏”原理评估新型冠状病毒核酸检测中的孔间污染,可准确、快速预测可能存在污染的孔位,避免多次复检,减少核酸检测工作量。