江苏宿迁地区长链非编码RNA H19基因多态性与胃癌易感性的关联分析*

邱 巍,陈素梅,刘东声

徐州医科大学附属宿迁医院检验科/江苏省宿迁市检验医学重点实验室,江苏宿迁 223800

胃癌在全球各种恶性肿瘤中的发病率位于第6位、病死率位于第3位[1]。在我国各种恶性肿瘤中其发病率位居首位、病死率位居第2位。长链非编码RNA(LncRNA)是由RNA聚合酶Ⅱ转录而来,是一种不能编码蛋白质、长度超过200 bp的RNA,在组织和细胞中表现出较强的特异性[2]。LncRNA H19最早被发现位于人类染色体11p15.5上,包含5个外显子和4个内含子,其第5个外显子上的Rsal多态酶切位点可以与胰岛素样生长因子2(IGF-2)组成H19/IGF-2印记基因群[3]。LncRNA H19在胚胎发育时期表达水平较高,但出生后在大部分组织器官内的表达水平都显著下降[4]。LncRNA H19在不同的恶性肿瘤中发挥着作用,在部分肿瘤中有着促癌作用,如肝癌[5]、肾癌[6]、乳腺癌[7]等。本研究采用限制性片段长度多态性PCR技术分析了LncRNA H19 在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位点的基因型频率分布与胃癌的易感性,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年1月至2021年12月本院收治的胃癌患者265例作为胃癌组,同期健康体检者284例作为对照组。胃癌组纳入标准:符合中华人民共和国卫生行业标准胃癌诊断标准[8];经组织病理学检查确诊为胃癌;术前未经放、化疗。排除标准:患有其他类型肿瘤。对照组纳入标准:经过病史询问和实验室检查排除心脑血管疾病、糖尿病、肿瘤、消化系统疾病及其他全身性疾病。两组人群均为宿迁地区汉族人群,年龄、性别比例相匹配且个体之间均无血缘关系。胃癌组平均年龄(65.40±11.38)岁,男192例,女73例;对照组平均年龄(64.71±4.74)岁,男222例,女62例。两组一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。胃癌组年龄<60岁患者68例,≥60岁患者197例。对照组年龄<60岁患者59例,≥60岁患者225例。本研究经医院医学伦理委员会批准,所有研究对象均知情同意。

1.2仪器与试剂 Eppendorf 5424R离心机为德国艾本德公司生产,Bio-Rad T100 PCR仪为美国伯乐公司生产,DYY-8C型电泳仪为北京六一仪器厂生产,FR-980A生物电泳图像分析系统为上海复日科技有限公司生产,752紫外可见分光光度计为上海佑科仪器仪表有限公司生产,血液基因组DNA提取试剂盒为北京天根生化科技公司生产,PCR试剂盒为大连宝生物工程有限公司生产,酶切试剂盒为美国纽英伦生物技术有限公司生产。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取 采集两组研究对象空腹状态下5 mL EDTA-K2抗凝的全血。采用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,使用紫外分光光度计检测DNA水平和纯度。将提取的基因组DNA溶解于TE缓冲液中,置于-20 ℃冰箱保存。

1.3.2引物设计 LncRNA H19在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位点引物设计参照文献[9]。rs217727 C>T上游引物序列:5′-GTCGCTATCTCTAGGTGAAG-3′;下游引物序列:5′-GTGGAGGCTTTGAATCTCTC-3′;产物片段大小为291 bp。rs2839698 C>T上游引物序列:5′-AAGGAGCACCTTGGACATCT-3′;下游引物序列:5′-CTGCCACGTCCTGTAACCAA-3′;产物片段大小为226 bp。

1.3.3PCR反应 使用Takara PCR试剂盒,25.0 μL反应体系:5 U/μL Ex Taq 0.2 μL,10×buffer(Mg2+free)2.5 μL,25 mmol/L MgCl22.0 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μL,10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL,DNA模板2.0 μL,ddH2O补足体积。rs217727 C>T位点的循环参数:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,64 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s,共40个循环;72 ℃ 10 min。rs2839698 C>T位点的循环参数:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63 ℃ 40 s,72 ℃ 45 s,共40个循环;72 ℃ 10 min。

1.3.4酶切反应 使用NEB酶切试剂盒,rs217727 C>T位点的20 μL酶切体系:PCR产物5 μL,EciⅠ1 μL,10×NEBuffer 5 μL,ddH2O 9 μL,37 ℃酶切1 h。rs2839698 C>T位点的20 μL酶切体系为PCR产物5 μL,KasⅠ 1 μL,10× NE Buffer 5 μL,ddH2O 9 μL,37 ℃酶切1 h。使用3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物。

2 结 果

2.1基因分型结果 在rs217727 C>T位点,PCR产物经EciⅠ酶切后TT基因型为291 bp的1条片段;CT基因型为145、146、291 bp的3条片段;CC型为145、146 bp的2条片段。在rs2839698 C>T位点,PCR产物经KasⅠ酶切后TT基因型为226 bp的1条片段;CT基因型为106、120、226 bp的3条片段;CC基因型为106、120 bp的2条片段。

2.2两组基因多态性分布比较 经Hardy-Weinberg遗传平衡吻合度检验,rs217727 C>T位点在胃癌组(χ2=0.09,P=0.762)和对照组(χ2=0.62,P=0.430),rs2839698 C>T位点在胃癌组(χ2=2.62,P=0.106)和对照组(χ2=0.63,P=0.427)中基因型分布均符合遗传平衡定律。

经Logistic回归校正年龄、性别后胃癌组和对照组rs217727 C>T位点CC基因型与TT基因型频率比较,差异有统计学意义(χ2=6.33,P<0.05),与CC比较,TT纯合子发生胃癌的风险是其1.93倍(OR=1.93,95%CI=1.15～3.25);CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.97,P>0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=2.46,P>0.05);胃癌组T等位基因频率高于对照组,差异有统计学意义(χ2=6.15,P<0.05)。两组rs2839698 C>T位点CC基因型与TT基因型频率比较,差异有统计学意义(χ2=4.49,P<0.05),与CC比较,TT纯合子发生胃癌的风险是其1.91倍(OR=1.91,95%CI=1.04～3.51); CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.82,P>0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.82,P>0.05);胃癌组T等位基因频率高于对照组,差异有统计学意义(χ2=5.12,P<0.05)。见表1、2。

表1 两组rs217727 C>T位点基因型与等位基因频率比较[n(%)]

表2 两组rs2839698 C>T位点基因型与等位基因频率比较[n(%)]

2.3年龄、性别与基因型频率的关系 将胃癌组和对照组分别按年龄分层后发现:两组间rs217727 C>T位点在年龄<60岁研究对象中CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.58,P>0.05);CC基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=2.11,P>0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.90,P>0.05)。在年龄≥60岁研究对象中CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.29,P>0.05);CC基因型与TT基因型频率比较,差异有统计学意义(χ2=3.95,P<0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.50,P>0.05)。两组间男性CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.63,P>0.05),CC基因型与TT基因型频率比较,差异有统计学意义(χ2=4.95,P<0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.83,P>0.05)。女性CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.15,P>0.05);CC基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.27,P>0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.82,P>0.05)。见表3、4。

表3 两组rs217727 C>T位点年龄与基因型频率的关系[n(%)]

表4 两组rs217727 C>T位点性别与基因型频率的关系[n(%)]

在rs2839698 C>T位点:年龄<60岁研究对象中CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.61,P>0.05);CC基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.05,P>0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.24,P>0.05)。在年龄≥60岁研究对象中CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.73,P>0.05);CC基因型与TT基因型频率比较,差异有统计学意义(χ2=4.42,P<0.05); CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=2.37,P>0.05)。两组间男性CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.31,P>0.05);CC基因型与TT基因型频率比较,差异有统计学意义(χ2=4.27,P<0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.80,P>0.05)。女性CC基因型与CT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.12,P>0.05);CC基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=1.19,P>0.05);CT基因型与TT基因型频率比较,差异无统计学意义(χ2=0.67,P>0.05)。见表5、6。

表5 两组rs2839698 C>T位点年龄与基因型频率的关系[n(%)]

表6 两组rs2839698 C>T位点性别与基因型频率的关系[n(%)]

3 讨 论

随着研究的深入,大量研究表明,LncRNA与肿瘤的发生、发展密切相关,其参与了基因印记、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的过程[10-11],从而调控了肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭等生物学行为[12-14]。LncRNA H19通过不同的调节机制在不同类型的肿瘤中发挥促癌作用。单核苷酸多态性(SNP)是人类最常见的遗传变异,主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列的改变。有研究发现,LncRNA上的功能性SNP位点可能通过转录调控影响LncRNA的表达,从而在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用[15]。

在本研究中,LncRNA H19 rs217727 C>T位点在胃癌组的等位基因T频率为0.440,显著高于对照组的0.366(χ2=6.15,P<0.05);rs2839698 C>T位点在胃癌组的等位基因T频率为0.309,显著高于对照组的0.248(χ2=5.12,P<0.05)。两个位点中胃癌组和对照组TT基因型与CC基因型频率比较,差异均有统计学意义(P<0.05),与CC比较, rs217727 C>T位点TT纯合子有1.93倍的胃癌风险(OR=1.93,95%CI=1.15～3.25),rs2839698 C>T位点TT纯合子有1.91倍的胃癌风险(OR=1.91,95%CI=1.04～3.51),说明rs217727 C>T和2839698 C>T位点中的突变T等位基因可能是胃癌的危险因素。两个位点在年龄≥60岁男性中CC基因型与TT基因型频率比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。这表明在rs217727 C>T和rs2839698 C>T位点中的基因型变异使发生胃癌的风险增加,在年龄≥60岁的男性中更为显著。这可能与累积暴露于存在致癌物的环境中及老年人的免疫系统较弱相关。YANG等[16]关于中国汉族人群LncRNA H19多态性与胃癌相关性的研究结果显示,在rs217727和rs2839698位点中的基因型变异在<59岁的人群中更为显著。这一结论与本研究结果相反,还需要进一步的研究来验证。PEI等[9]在对LncRNA H19的遗传变异与中国台湾地区儿童白血病的易感性研究中发现, SNP rs2839698位点与儿童白血病有关联性,而rs217727位点则无相关性。LI等[17]在LncRNA H19遗传变异与中国人群结直肠癌风险的关系研究中报道,rs2839698位点与结直肠癌风险升高有关,rs3024270、rs217727和rs2735971位点与结直肠癌风险无关。TAN等[18]在LncRNA H19多态性与中国人群肝母细胞瘤风险的相关性研究中报道,rs2839698、rs3024270和rs217727基因多态性与中国汉族人群肝母细胞瘤易感性相关。LncRNA H19基因多态性与肿瘤的遗传易感性研究结论不尽相同,这可能与研究对象的样本量、代表性和遗传背景有关。肿瘤的发生涉及多个基因的变异,研究单个基因的SNP往往存在一定的局限性。