血清miR-21、miR-145表达水平对卵巢癌患者化疗效果及预后的评估价值研究*

牛芳蕾,刘红霞

1.延安大学咸阳医院妇科,陕西咸阳 712000;2.陕西省神木市医院妇科,陕西榆林 719300

卵巢癌属于妇科临床上较为常见的恶性肿瘤,具有恶性程度高、治疗难度大等特点,严重威胁女性的身心健康[1]。该病发病早期具有极强的隐匿性,患者往往无典型症状,大部分患者首次确诊已是中晚期,丧失了手术根治的最佳时机[2]。化疗是目前临床上治疗中晚期卵巢癌的重要手段之一,化疗效果直接影响患者的预后。微小核糖核酸(miRNA)是近年来研究发现的一类非编码RNA,广泛介导了人体内正常细胞的生物学行为[3-4]。miR-21属于miRNAs家族成员之一,已有研究表明其可能发挥类似促癌基因的作用[5]。而miR-145亦是miRNAs家族成员之一,相关研究证实其可能发挥类似抑癌基因的作用[6]。但卵巢癌患者血清miR-21、miR-145表达水平及其对化疗效果及预后的评估作用尚不明确,鉴于此,本研究旨在探讨血清miR-21、miR-145表达水平对卵巢癌化疗患者疗效及预后的评估价值,现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年3月至2019年3月延安大学咸阳医院收治的80例卵巢癌化疗患者作为研究对象。患者年龄35～78岁,平均(56.27±10.62)岁;体质量指数18～32 kg/m2,平均(23.51±1.76)kg/m2;分化程度:低分化35例,中高分化45例;TNM分期:Ⅱ期49例,Ⅲ～Ⅳ期31例;淋巴结转移33例,无淋巴结转移47例;组织学类型:浆液性49例,黏液性31例。按照化疗效果的差异将其分为部分缓解(PR)组41例,疾病稳定(SD)组22例,疾病进展(PD)组17例。疗效判断标准:PR即病灶缩小>30%,无其他病变,且持续超过1个月;SD即病灶缩小≤30%或病灶增大<20%;PD即病灶增大≥20%或出现新病灶[7]。

纳入标准:(1)有明确病理检查结果,且为首次化疗;(2)具备完善的病历资料。排除标准:(1)伴有其他恶性病变;(2)心、肺等脏器功能严重异常;(3)神志异常;(4)因故无法完成随访或退出;(5)存在化疗禁忌证。本研究患者均知情且签署同意书,本研究经医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1患者临床资料收集 借助医院病历系统完成各项基线资料的记录、统计,包括年龄、体质量指数、分化程度、TNM分期、组织学类型、淋巴结转移情况等。

1.2.2给药方案 包括TC方案(卡铂联合紫杉醇)以及TP方案(顺铂联合紫杉醇)。(1)TC方案即予以紫杉醇注射液静脉滴注,给药剂量为175 mg/m2,首次治疗静脉滴注3 h;卡铂按照浓度-时间曲线的曲线下面积为5计算后进行静脉滴注。以21 d为1个疗程,连续治疗2个疗程。(2)TP方案即予以紫杉醇注射液260 mg/m2+顺铂75 mg/m2。给药方式均为静脉滴注,以21 d为1个疗程,连续治疗2个疗程。

1.2.3标本采集 抽取所有患者化疗6个周期后的晨起进食前静脉血5 mL,离心处理(离心半径8 cm,离心速度3 500 r/min,离心时长10 min)后,获取上层血清。

1.2.4指标检测 采用RNA提取试剂盒(赛默飞中国有限公司,生产批号:015244)提取总RNA,之后以反转录试剂盒(赛默飞中国有限公司,生产批号:015129)进行RNA反转录,获取cDNA。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测miR-21、miR-145表达水平。反应条件:反应体系20.0 μL,其中cDNA模板2.0 μL,上下游引物各0.8 μL,ddH2O 6.4 μL,miScript SYBR Green Mix 10.0 μL。反应参数:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40个循环。其中miR-21、miR-145与内参U6的引物均由天根生化科技有限公司设计合成。所有样品均设置3个重复孔,以2-ΔΔCt法完成血清miR-21、miR-145相对表达量的计算。miR-21上下游引物序列分别如下:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′,5′-GCCGCTAGCTTA TCAGACTGATGT-3′;miR-145上下游引物序列分别如下:5′-CCTCACGGTCCAGTTTTCCC-3′,5′-GCAAATCCAGCTGTGAAACCA-3′。

1.3随访 对所有患者均开展为期3年的随访,随访方式为门诊复查随访以及电话随访,随访内容为患者预后情况。随访频率为每3个月1次,随访截至患者死亡或3年期满。根据随访结果,将患者分为死亡组及存活组。

1.4观察指标 (1)比较不同化疗效果以及预后患者的血清miR-21、miR-145表达水平。(2)比较不同预后患者的各项基线资料,分析卵巢癌化疗患者预后的影响因素。(3)分析血清miR-21、miR-145表达水平预测卵巢癌化疗患者预后的效能。

2 结 果

2.1不同化疗效果患者血清miR-21、miR-145表达水平比较 PR组、SD组血清miR-21表达水平低于PD组,且PR组血清miR-21表达水平低于SD组,PR组、SD组血清miR-145表达水平高于PD组,且PR组血清miR-145表达水平高于SD组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同化疗效果患者血清miR-21、miR-145表达水平比较

2.2影响卵巢癌化疗患者预后的单因素分析 经随访,患者死亡20例、存活60例。单因素分析发现:两组年龄、分化程度、TNM分期、淋巴结转移情况及血清miR-21、miR-145表达水平比较,差异有统计学意义(P<0.05)。而两组体质量指数、组织学类型比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 影响卵巢癌化疗患者预后的单因素分析或n(%)]

2.3卵巢癌化疗患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析 采用非条件Logistic回归将卵巢癌化疗患者预后情况视作因变量,赋值为死亡=1,存活=0。以年龄、分化程度、TNM分期、淋巴结转移以及血清miR-21、miR-145表达水平为自变量。考虑到样本量较少,将所有自变量均转换为二分类变量(即自变量降维),利于稳健回归。经多因素Logistic回归分析发现:年龄≥60岁、低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移以及血清miR-21表达水平>3.5、血清miR-145表达水平<3.5为卵巢癌化疗患者死亡的危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 卵巢癌化疗患者预后影响因素的多因素Logistic回归分析

2.4血清 miR-21、miR-145表达水平预测卵巢癌化疗患者预后的ROC曲线分析 以死亡组(20例)为阳性样本,存活组(60例)为阴性样本,建立ROC曲线预测分析模型。两项指标单独应用时参考临床实践划分成若干个组段,再以软件拟合为ROC曲线读取约登指数最大值点,对应计算理论阈值和各项参数。并按实测样本计算灵敏度、特异度、准确度。联合应用(LogP模式)以Logistic回归将血清miR-21、miR-145表达水平作为自变量,建立风险评估/预测回归模型(表4),以Log(P/1-P)=-0.043+0.097×XmiR-21表达水平-0.074×XmiR-145表达水平为联合应用的虚拟概率量指标,再进行ROC曲线分析。分析结果显示:血清miR-21、miR-145两项指标单独及联合应用时曲线下面积(AUC)分别为0.734(95%CI:0.479～0.990)、0.702(95%CI:0.437～0.968)、0.844(95%CI:0.717～0.960),联合应用的诊断效能最高,AUC及灵敏度、特异度、准确度均较各单项指标有明显提升。见表5和图1。

图1 血清miR-21、miR-145预测卵巢癌化疗患者预后的ROC曲线

表4 血清 miR-21、miR-145联合预测卵巢癌化疗患者预后的LogP模型构建

表5 血清miR-21、miR-145预测卵巢癌化疗患者预后的效能分析

3 讨 论

目前,有关卵巢癌的具体发病机制及病因尚未彻底阐明[8]。虽然近年来针对卵巢癌的治疗手段已明显进步,且治疗效果亦有一定提升,但仍有部分患者治疗后复发,且生存率并未获得显著提升。因此,研究和疾病转归有关的敏感指标对制订疾病治疗策略具有重要意义。有研究发现,大约有1/2的人类miRNA定位在与肿瘤密切相关的基因组,且能通过调控多个靶基因的表达进而调控多种细胞生物学进程,提示了miRNA在肿瘤发生、发展过程中发挥着重要作用[9]。miR-21[10]、miR-145[11]是目前国内外研究较多的miRNA,在胃癌、肝癌及肺癌等多种肿瘤中存在异常表达。其中miR-21可能在恶性肿瘤中扮演着促癌基因的角色,而miR-145可能扮演着抑癌基因的角色,二者均可通过对相关下游靶基因或蛋白表达进行调控,进而参与恶性肿瘤的发生、发展过程。

本研究结果显示,化疗后效果较好的患者血清miR-21表达水平低于效果较差的患者,而miR-145表达水平高于效果较差的患者。这提示了血清miR-21、miR-145表达水平与卵巢癌患者化疗效果密切相关,即随着miR-21表达水平的升高以及miR-145表达水平的降低,患者化疗效果越差。究其原因:miR-21可能通过调节β-catenin通路活性,进而提高肿瘤细胞的增殖及侵袭能力,从而增加临床治疗难度,当其表达水平异常升高时,往往反映了患者病情加剧,从而难以从标准剂量药物中获益,最终影响化疗效果[12]。miR-145可发挥减少肿瘤细胞数量,抑制肿瘤干细胞特性等作用,当其表达水平下降时,其抑癌作用下降,肿瘤细胞增殖、分化加剧,且为肿瘤细胞的侵袭、转移提供了重要基础,最终导致化疗效果欠佳[13]。

此外,本研究发现随访3年后,80例患者中死亡20例,存活60例。经多因素Logistic回归分析发现:年龄≥60岁、低分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移以及血清miR-21表达水平>3.5、血清miR-145表达水平<3.5均为卵巢癌化疗患者死亡的危险因素(P<0.05)。究其原因,随着年龄的不断增长,患者机体抵抗力及免疫力均会出现不同程度的降低,且对化疗的耐受性下降,因此可能影响化疗效果,最终不利于疾病转归。分化程度越低、TNM分期越晚以及淋巴结转移的发生均会导致患者病情加剧,损坏患者卵巢功能,从而增加临床治疗难度,导致预后不良。而miR-21可通过激活Wnt信号通路调节CD44v6的表达进而影响肿瘤细胞的自噬,促进细胞增殖、迁移及侵袭,最终影响预后[14-15]。miR-145可能通过靶向调控SOX11基因的表达,进一步抑制肿瘤细胞的生长,发挥类似于抑癌基因的作用[16-18]。另外,经ROC曲线分析发现:血清 miR-21、miR-145联合预测卵巢癌化疗患者预后的效能优于上述两项指标单独预测。这反映了联合检测血清miR-21、miR-145表达水平对卵巢癌患者预后的预测价值较高。可能是联合检测上述两项血清学指标水平,可为临床预测患者预后提供较为全面的依据,最终提高预测效能。这也充分提示了联合检测更具应用价值[19-20]。

综上所述,随着血清miR-21表达水平的升高以及miR-145表达水平的降低,卵巢癌化疗患者效果越差,且预后相对不良。因此,临床工作中可通过检测上述两项血清学指标水平,进而为疗效评估以及预后预测提供参考依据。