黑核桃组培中消毒及防止褐化最适浓度分析

付 强,王 琴,徐彩芹,牛俊丽,牛建新,王建友

(1.石河子大学农学院,新疆石河子 832003;2.新疆林业科学院经济林研究所,乌鲁木齐 830063;3.新疆林业科学院,乌鲁木齐 830063)

0 引 言

【研究意义】美国黑核桃(Juglansnigra)属核桃科(Juglandaceae)核桃属(JuglansL.)黑核桃种,原产北美洲。目前已栽培的树种包括北加州黑核桃、魁核桃、小果黑核桃及奇异核桃等,在我国新疆、河南、山东、吉林、陕西等地均有种植[1],黑核桃果实营养丰富、风味浓厚,木材结构细腻、加工性能优良,抗逆能力强[2]。核桃的繁殖方式主要为实生、嫁接以及扦插,黑核桃主要采用实生繁殖,秋播萌发率可达90%,但常规方法繁殖黑核桃,繁殖速度慢,种苗昂贵,用种量大,且易发生遗传变异,不能保持品种优良性状,影响黑核桃的推广进程[3]。【前人研究进展】Ricardo等[4]为改进核桃微繁殖现有方法,基因型是影响核桃微繁殖整体成功的主要因素,FeEDDHA和PG组合使用可显著提高驯化过程中试管苗生根率和植株存活率;Stevens[5]记录了meta-topolin (MT)对所有核桃品种(尤其是黑核桃)的培养和苗伸长的益处;Tuan等[6]从胚轴开始诱导,成功进行离体生根,固体培养基的芽增值效果优于液体培养基;Kourosh等[7]以山核桃茎段为外植体,经过低温处理,成功诱导生根并获得完整植株。刘淑兰等[8]最早开始核桃组培的研究,以叶柄、茎尖等作为外植体诱导出了愈伤组织;袁巧平等[9]以成年树的嫩梢为外植体,诱导形成不定芽,经过生根处理获得了完整植株;汤浩茹等[10]以幼胚和子叶成功诱导了体细胞胚并萌发成苗;王清民等[11]以成年树幼嫩茎段为外植体,用两步诱导生根法分析核桃试管苗扦插生根。Tarinejad等[12]以黑核桃为材料,在培养基中添加抗生素,混合添加12.5 mg/L庆大霉素和100 mg/L万古霉素可以有效控制污染。宋锋惠等[13]以黑核桃的茎段为外植体进行组织培养,发现茎段内含菌较多,污染率高、易发生氧化褐变,缩短转瓶周期可减轻褐变现象,获得无菌外植体是黑核桃组培成败的关键。【本研究切入点】目前,对于黑核桃种的组织培养研究较少,需研究黑核桃组培中,不同消毒时长和抗褐化剂配比对污染和褐化的影响。【拟解决的关键问题】筛选出消毒的最佳时长和最适抗褐化剂浓度,研究外植体褐化过程中细胞结构的变化,为建立稳定高效的黑核桃植株再生体系和核桃快速繁殖及工厂化育苗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

材料于2021年4～5月采集自新疆林业科学院珍稀树木园,以10～15 a黑核桃当年萌发的叶片和带腋芽或顶芽的幼嫩茎段为外植体。

基本培养基为DKW培养基,培养室内温度为(25±2)℃,光照强度1 800 lx,光照时间∶暗时间=14 h∶10 h,pH值5.8～6.2。

1.2 方 法

1.2.1 外植体消毒

叶片在流水中反复冲洗,在超净工作台上用70%酒精消毒10s后,无菌蒸馏水冲洗2次。用0.1%HgCl2分别消毒4、5、6、7 min(A1、A2、A3、A4),将叶片切成1 cm×1 cm的大小,叶面向上接种在DKW+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂培养基中。

茎段在流水中冲洗4～6 h,软毛刷轻刷整个枝条,刷洗掉表面灰尘。将其剪成1.5～2 cm的带1～2个腋芽的茎段,在超净工作台上用70%酒精消毒30 s后,无菌蒸馏水冲洗2次,以0.1%HgCl2加少量吐温80为消毒剂,共设置6个处理,其中单次消毒时间分别8、10、12 min(B1、B2、B3),二次消毒时间分别4、5、6 min(B4、B5、B6)。接种在DKW+30 g/L蔗糖+8 g/L琼脂培养基中。每个处理设3个重复,3周后统计污染率、褐化率。

污染率(%)=(污染的外植体数/接种的外植体数)×100%;

褐化率(%)=(褐化的外植体数/接种的外植体数)×100%;

萌发率(%)=( 萌发的外植体数/接种的外植体数) ×100 %。

1.2.2 抗褐化剂不同浓度配比对褐化率影响

以AC、PVP、VC 3种抗褐化剂,按照L9(34)正交表进行3因素3水平试验处理(C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9)。每个处理设3个重复,3周后统计褐化率、萌发率。表1

1.2.3 褐化外植体细胞切片观察

分别取新鲜外植体和接种后5、10、15、25、30、40 d的外植体,制作徒手切片,显微镜下观察其在组织培养过程中细胞结构的变化。

1.3 数据处理

采用Excel 统计处理数据,利用SPSS 21.0 对试验数据进行方差分析和差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 不同消毒时间对污染的影响

研究表明,随着消毒时间的增加,污染率下降,褐化率上升。0.1%HgCl2消毒4 min时,污染率最高,与7 min时相较污染率高14.11%;消毒7 min褐化率最高,比4 min时高23.95%。消毒5 min和6 min的污染率无显著差异,由于在HgCl2中消毒时间较长,6 min时的褐化率比5 min高11%。叶片表面消毒处理2效果最好,即0.1%HgCl2中消毒5 min。表2

表2 不同消毒时间下叶片污染率和褐化率变化

不同消毒时长对茎段的污染率及褐化率影响显著。随着消毒时间的增加,污染率下降,褐化率急剧上升,消毒12 min时污染率最低为14.29%,褐化率最高可达57.14%。HgCl2对植物有一定的毒害作用,长时间浸泡在HgCl2中消毒会引起外植体褐化死亡,不同的消毒方式对消毒结果差异显著,处理3和处理6相比,二次消毒可使褐化率下降30.47%。茎段表面消毒以处理5效果最好,即用二次消毒法0.1%HgCl2+吐温80消毒5 min。图1,表3

注：A.接种5 d后的外植体;B.腋芽萌动的外植体;C.腋芽萌发的外植体;D.褐化死亡的外植体

表3 不同消毒时间下茎段污染率和褐化率变化

2.2 不同抗褐化剂对褐化率和萌发率的影响

研究表明,不同抗褐化剂配比对外植体的褐化率和萌发率影响显著。9个处理中褐化率最高的为处理4,56.67%的外植体发生了褐化。萌发率最高的抗褐化剂为AC 1 g/L、PVP 70 mg/L、VC 50 mg/L。添加AC 2 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L的褐化率和萌发率都最低,褐化率比处理4降低了35%,萌发率比处理1降低了18.33%。添加了高浓度AC的处理,腋芽的萌发率较低,最低仅有26.67%,且萌发时间较晚,生长较慢。表4

表4 抗褐化剂不同浓度配比下褐化率和萌发率变化

褐化率KAC1RVC>RPVP,3种抗褐化剂对褐化率的影响主次顺序是AC>VC>PVP,即AC对褐化率影响最大,其次VC,PVP影响较小,AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L为抑制褐化的最优水平组合,黑核桃茎段抑制褐化的最佳抗褐化剂浓度为AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L。

萌发率KAC1RPVP>RVC,3种抗褐化剂对萌发率的影响主次顺序是AC>PVP>VC,即AC对萌发率的影响最大,其次是PVP,VC影响较小,AC 1 g/L、PVP90 mg/L、VC 50 mg/L为萌发的最优水平组合,黑核桃茎段萌发率最佳的抗褐化剂配比为AC 1 g/L、PVP 90 mg/L、VC 50 mg/L。

抗褐化剂最优的水平组合为AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L。表5

表5 极差分析

2.3 外植体细胞切片的观察

研究表明,不同褐化时期的带芽茎段细胞结构差异较大。0 d为未出现褐化的健康外植体,细胞颜色淡绿,质地通透,边缘较为圆润。5 d时的外植体开始出现褐化,变为黄绿色,细胞比健康外植体较小,细胞中开始有褐色物质出现。10 d时的外植体切片与5 d时的切片无明显差异,细胞变为淡黄色,细胞中的褐色物质出现更多。15 d时褐化现象明显,细胞切片中的褐色物质出现更多,褐色物质集中地方的细胞破裂,胞液外流,细胞边界模糊。25 d时褐化现象严重,细胞中的褐色物质增多,开始向其他细胞间隙扩散,细胞逐渐失去活性。30 d时切片完全变为褐色,褐色物质已经充满细胞间。40 d时切片颜色变为黑色,外植体已完全褐化死亡。图2

图2 褐化外植体细胞切片

3 讨 论

组织培养中通常会以幼嫩组织作为外植体[14],获得无菌外植体是建立离体快繁体系的基础。李颖等[15]在培养基中添加多菌灵和青霉素来控制污染,发现多菌灵能够有效消灭真菌,青霉素在初代培养时能抑制细菌作用。郑小琴等[16]研究发现随着灭菌时间延长,污染率递减,但褐化率上升。试验中以0.1%HgCl2为消毒剂,设计了不同时间梯度,叶片0.1%HgCl2消毒5 min效果最好,茎段采用二步消毒法,0.1%HgCl2加吐温80消毒5 min效果最好。当叶片消毒6 min时,污染率无显著变化,褐化率却显著增加,随着消毒时间的增加,污染率下降,与郑小琴等[16]研究结果相同。外植体伤口处长时间接触HgCl2,细胞被破坏,酚类物质增多,褐化率增加。不同外植体采用的消毒剂种类及消毒时长受外植体的类型、大小等因素影响[17]。消毒时间过短会,消毒不彻底;消毒时间过长,又损伤外植体,增加褐化率,造成植体死亡。

褐化是核桃属的植物较难进行组织培养的重要原因,核桃属植物的酚类物质含量较多,外植体易发生褐化[18-19]。组织培养中褐化主要受外植体的类型、生理状况、植物种类、基因型等因素的影响[20]。多酚氧化酶与酚类物质作用产生褐化现象[21],在梨[22]、葡萄[23]等多种植物中都已得到证明。王娟等[24]发现酚类物质氧化过程中,许多酶的活性是受光诱导的,前期暗培养对防止褐化有较好的效果;章铁等[25]发现缩短转瓶周期可减少茎段伤口附近的酚类物质。J.I.Mir等[26]研究多个核桃品种,发现VC浓度为350 mg/L时的抗褐化效果最好,CA为350 mg/L的条件下不定芽数量最多。生产中多在培养基添加吸附剂和抗氧化剂来减少褐化,常用的抗褐化剂包括AC、PVP、VC、Na2S2O3、AgNO3等[27]。试验结果显示,抗褐化剂的最适浓度为AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L,由于试验树种不同,VC的最适浓度比J.I. Mir等[26]的试验结果较低。观察褐化外植体的切片,发现随着褐化程度的加深,细胞中出现大量褐色物质。关于控制污染及褐化,获得无菌外植体的试验,有待进一步研究。

4 结 论

以黑核桃叶片为外植体时,70%酒精消毒10s后,0.1%HgCl2消毒5 min效果最好。以茎段为外植体时,70%酒精消毒30s后,以二次消毒法,0.1%HgCl2加吐温80消毒5 min,效果最好。当AC、PVP、VC组合使用时,AC 1 g/L、PVP 110 mg/L、VC 100 mg/L的抑制褐化效果最好。随着褐化程度加深,细胞中有大量褐色物质积累并逐渐破裂、失活、死亡。