黄肝煎液对胆汁淤积性肝损伤大鼠的保护作用及急性毒性研究*

雷亚亚，郝秀娟，王亚楠，马学礼，赵玉娜，王紫燕，陈晶**

1宁夏医科大学总医院制剂中心，银川 750004；2兴庆区健康教育所，银川750001

胆汁淤积是指各种原因造成胆汁形成、分泌和排泄障碍，胆汁不能正常流入十二指肠而进入血液的病理状态，临床可表现为瘙痒、乏力、尿色加深和黄疸等。随着病情进展，患者可出现高胆红素血症，严重者可导致肝硬化肝衰竭甚至死亡[1]。熊去氧胆酸等传统药物能促进胆汁酸从肝肠中清除，延缓疾病进展，但仍存在一定局限性[2，3]。中医药基于整体论治体系以及多成分多靶点的作用特点在疾病综合治疗中独具优势[4，5]。黄肝煎液作为本院特色中药制剂（备案号：宁药制备字Z20200 020000；规格：180 mL/袋），是根据传统验方“茵陈蒿汤”加减化裁而来，具有清利湿热、利胆退黄的功效，用于黄疸型肝炎及胆汁淤积治疗时，口服，一次90 mL，一日2次。黄肝煎液临床疗效显著，深受广大医患的欢迎，已成为宁夏及周边地区肝病患者保肝利胆的区域特色药物。然而，尚缺乏科学系统的药效学评价及作用机制研究，从而限制相关制剂的开发。本研究通过α-萘异硫氰酸酯（α-naphthalene isothiocyanate，ANIT）构建胆汁淤积性肝损伤大鼠模型，考察黄肝煎液对模型大鼠胆汁淤积性肝损伤的保护作用；并通过急性毒性试验评价制剂的安全性，进而为其临床安全使用、深层次机制研究及新制剂开发提供理论依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AU5800 型全自动生化分析仪（美国Beckman Coulter 公司）；CLARIO star Plus 型多功能酶标仪（美国BioTek 公司）；RM2016 病理切片机（德国Leica 公司）；HH-2 型数显恒温水浴锅（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；DM400B 型荧光显微镜（德国Leica 公司）。

1.2 试药

1.3 实验动物

SD 大鼠72只，体质量为190～210 g，雌雄各半；KM 小鼠，体质量为18～22 g，雌雄各半，均由宁夏医科大学实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK（宁）2020-0001。分笼饲养，自由进食进水。饲养环境干燥舒适，通风良好，温度21～25℃，湿度55%～65%。本动物实验经宁夏医科大学实验动物伦理委员会批准进行（2020-072），实验过程符合国家和单位有关实验动物的管理和使用规定。

2 方法

2.1 黄肝煎液的制备及质量检查

2.1.1 制备 茵陈、黄芩、黄柏、当归及大黄等处方药味，加适量水浸泡30 min，加热煎煮2次，第一次2 h，第二次1 h，合并煎液，滤过，滤液加热浓缩至浓度为0.815 g·mL-1，灌装，灭菌，即得黄肝煎液制剂。

2.1.2 质量检查 依据《中国药典》2020 年版pH 值测定法（通则0631）[6]，测定黄肝煎液pH 值应为4.0～6.0；依据相对密度测定法（通则0601 比重瓶法），测定相对密度应不低于1.02[7]；依据茵陈含量测定，采用高效液相色谱法测定绿原酸含量，每袋以绿原酸总量计，不得少于60 mg[8]。

2.1.3 实验用药液制备 按照黄肝煎液制剂配制工艺，依次煎制质量浓度为0.407 5、0.815、1.63 g·mL-1的黄肝煎液，即为黄肝煎液低（HGYJ-L）、中（HGYJ-M）、高（HGYJ-H）剂量。

2.2 黄肝煎液对大鼠胆汁淤积性肝损伤保护作用研究

2.2.1 动物造模与给药 72 只SD 大鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性对照组、黄肝煎液低、中、高剂量组，每组12 只。适应性饲养3 天后，黄肝煎液低、中、高剂量组分别灌胃HGYJ-L（3.85 g·kg-1）、HGYJ-M（7.70 g·kg-1）、HGYJ-H（15.40 g·kg-1）；阳性对照组灌胃UDCA（63 mg·kg-1）；正常对照组和模型组灌胃等量生理盐水，每天2次，连续给药14 d。除正常对照组给予等量橄榄油外，其它组均于第12天灌胃ANIT（100 mg·kg-1）造模[9，10]。

2.2.2 标本采集与处理 大鼠末次给药后禁食12 h，用3%戊巴比妥（40 mg·kg-1）麻醉，仰卧位固定，开腹，胆管插管并固定，自胆汁流出开始计时，收集0～15 min、15～30 min、30～45 min、45～60 min 的胆汁；胆汁收集结束后，腹主动脉取血，3000 r·min-1离心10 min，分离血清；处死大鼠，取肝组织备用。

2.2.3 胆汁流量测定 根据公式胆汁流量（μL·min-1·kg-1）=胆汁质量/体质量×15[11]计算胆汁流量。

应收账款是企业流动资产的重要组成部分，对应收账款的管理也尤为重要，很多企业通过赊销将商品迅速销售出去，扩大企业的市场，却不重视应收账款的管理，一些企业在赊销时并没有规定应收账款的还款期限，企业并不能控制资金的收回日期，在赊销中由主动方变成了被动方，加大了应收账款的不确定性。企业缺少对应收账款管理的规章制度，没有及时对应收账款计提坏账准备，忽视了应收账款所带来的风险，导致应收账款的回收、坏账准备等指标不准确，会计监督没有达到效果。企业这种只在乎眼前利益而不重视事后管理的行为就会导致企业应收账款回收的困难，降低企业资金周转的速度，企业的生产经营将会更加困难。

2.2.4 肝脏指数测定 根据公式肝脏系数（%）=肝质量/体质量×100%计算肝脏指数。

2.2.5 血清肝功能相关指标测定 使用全自动生化分析仪检测血清肝功能指标（ALT、AST、ALP 和Hyp）及黄疸指标（TBIL 和TBA）水平。

2.2.6 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察肝组织病理学改变 取大鼠肝组织，于4%多聚甲醛中固定后取出，依次进行脱水、石蜡包埋及切片处理，制备5 μm 切片。进一步脱蜡处理，经HE染色后，脱水、封片。将处理后的切片置于显微镜下观察肝组织形态变化[12]。

2.3 急性毒性试验[13,14]

2.3.1 急性毒性预实验 30 只KM 小鼠，随机分为3组，每组10只，雌雄各半。适应性饲养3 d后，各组小鼠分别灌胃给予质量浓度为1.63、0.815、0.4075 g·mL-1的黄肝煎液，灌胃体积为40 mL·kg-1，24 h 内给药3次，给药剂量分别为195.6、97.8、48.9 g·kg-1·d-1。连续观察14 d，记录小鼠体重、中毒及死亡数，计算半数致死量（LD50）。

2.3.2 最大给药剂量试验 40 只KM 小鼠，随机分为对照组和黄肝煎液组，雌雄各半。适应性饲养3天后，黄肝煎液组以最大给药浓度1.63 g·mL-1和最大给药体积40 mL·kg-1灌胃给予黄肝煎液，24 h 内给药3次，对照组灌胃给予等量生理盐水。观察并记录给药后14 d 内小鼠的急性毒性反应。

2.3.3 指标检测 小鼠急性毒性反应观察结束，眼眶取血，分离血清，采用全自动生化分析仪检测相关生化指标；处死小鼠，取心、肝、脾、肺和肾称定质量，计算脏器指数。

2.4 统计学分析

3 结果

3.1 黄肝煎液制剂质量检查

黄肝煎液制剂pH 值为4.87，相对密度为1.051，每袋含绿原酸为92.7 mg，符合制剂标准。

3.2 黄肝煎液对大鼠胆汁淤积性肝损伤保护作用

3.2.1 大鼠一般状态观察 造模前各组大鼠精神状态良好，体毛光滑，饮水及进食正常；给予ANIT造模后，模型组大鼠精神萎靡，体毛变粗糙，活动减少，饮水及进食减少，尿液出现黄褐色；HGJY-L 组大鼠活动略有减弱，而HGJY-M、HGJY-H 组和阳性对照组精神状态较好，体毛顺滑，活动、饮水和进食基本正常。

3.2.2 黄肝煎液对胆汁流量影响 与正常对照组比较，模型组大鼠胆汁流量明显减少；与模型组比较，黄肝煎液各组胆汁流量均有所增加，其中中、高剂量组胆汁流量升高尤为明显，差异具有统计学意义（P<0.01），见图1 及表1。结果表明，黄肝煎液可以显著提高ANIT 诱导胆汁淤积肝损伤大鼠的胆汁流量。

表1 黄肝煎液对ANIT 诱导的胆汁淤积性肝损伤大鼠胆汁流量、脏器指数及血清生化标志物指标影响（n=12，）

表1 黄肝煎液对ANIT 诱导的胆汁淤积性肝损伤大鼠胆汁流量、脏器指数及血清生化标志物指标影响（n=12，）

图1 黄肝煎液对ANIT 诱导的胆汁淤积性肝损伤大鼠胆汁流量的影响

3.2.3 黄肝煎液对大鼠肝脏指数的影响 表1 显示，与正常对照组比较，模型组与HGJY-L 组大鼠肝脏指数较显著升高，差异具有统计学意义（P<0.01），而HGJY-M、HGJY-H 组及阳性对照组肝脏指数未发生明显变化；与模型组比较，HGJY-M、HGJY-H 组及阳性对照组肝脏指数显著下降，差异具有统计学意义（P<0.01）。

3.2.4 黄肝煎液对大鼠血清生化指标的影响 与正常对照组比较，模型组大鼠血清中肝功能指标（ALT、AST、ALP 和Hyp）与黄疸指标（TBA 和TBIL）均明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。结合肝脏组织形态病理改变，表明ANIT 诱导的胆汁淤积肝损伤大鼠模型成功建立。与模型组比较，黄肝煎液组与阳性对照组血清肝功能指标和黄疸指标均显著降低，其中HGJY-M 组血清中ALT、AST、ALP 分别下降33.23%、58.00%、42.60%，TBA 和TBIL 分别下降25.53%、37.34%；HGJY-H 组血清中ALT、AST、ALP 分别下降49.73%、69.64%、45.97%，TBA 和TBIL 分别下降47.65%、45.57%，且HGJYH 组对肝损伤指标下调作用接近阳性对照组，差异具有统计学意义（P<0.01）。结果表明，黄肝煎液可以显著改善ANIT 诱导的胆汁淤积性肝损伤。同时显示对比模型组，HGJY-M、HGJY-H 组Hyp 显著下降（P<0.05），提示黄肝煎液对胆汁淤积所致的肝纤维化有一定的改善作用。

3.2.5 黄肝煎液对胆汁淤积性肝损伤大鼠肝组织病理学的影响 HE 染色结果（图2）显示，正常对照组大鼠肝小叶结构正常，肝细胞大致呈放射状排列，无变性坏死，未见明显炎性症状，血管及胆管结构正常；模型组大鼠肝脏静脉周围以及小叶内肝细胞肿胀变性，胞质疏松至空泡化，汇管区胆管增生（黑色箭头），中央静脉周围和汇管区可见大量炎细胞浸润（黄色箭头）；与模型组比较，黄肝煎液低剂量组大鼠肝组织炎性细胞浸润略减少，而HGJYM、HGJY-H 组及阳性对照组大鼠肝小叶结构基本正常，炎性细胞浸润明显减少，大鼠肝组织病理损伤显著改善。

图2 正常对照组（A）；模型组（B）；阳性对照组（C）；黄肝煎液低（D）、中（E）、高剂量组（F）大鼠肝组织形态（×200）

3.3 小鼠急性毒性试验

预实验结果显示，除部分小鼠拉稀便、体质量降低外，其余小鼠行为活动未见明显异常，无急性中毒症状，无法获得LD50值。因此，以最大给药剂量法进行急性毒性试验。

最大给药剂量试验中，对照组小鼠的外观状态、饮食、行为活动、排泄物等均正常，黄肝煎液组活动稍迟缓，饮食稍减少，部分小鼠拉稀便，3 h 后恢复正常。连续观察14 d，各组小鼠皮毛光滑，活动自如，一般状况良好，未出现死亡。黄肝煎液组与对照组小鼠体质量增长、各脏器指数及生化指标差异均无统计学意义（P ＞0.05），见表2～4。

表2 黄肝煎液对小鼠体质量的影响（n=20，）

表2 黄肝煎液对小鼠体质量的影响（n=20，）

表3 黄肝煎液对脏器指数的影响（n=20，）

表3 黄肝煎液对脏器指数的影响（n=20，）

表4 黄肝煎液对小鼠生化指标的影响（n=20，）

表4 黄肝煎液对小鼠生化指标的影响（n=20，）

4 讨论

胆汁淤积性肝损伤属中医“黄疸”“积聚”等范畴，根据古代医书记载，湿、热、瘀、毒作为黄疸主要病机，其多由湿热之邪蕴结肝胆，脉道不通，瘀阻血络而导致胆汁排泄不畅，液溢肌肤而发[15]。胆汁淤积性肝病临床常见且发病率逐年上升，主要表现为胆汁代谢紊乱和胆汁酸在肝脏过度蓄积。当胆汁酸正常代谢过程受阻时，疏水性胆酸盐等毒性成分在肝细胞内大量蓄积，进而导致肝细胞和胆管细胞损伤[16，17]。现代研究表明，体内胆汁酸主要经限速酶-胆固醇7-羟化酶调控合成，再经尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶等代谢，然后经胆盐输出泵和多药耐药相关蛋白等外排转运体介导经胆道排泄，在牛磺胆酸钠共转运多肽等作用下重吸收回到肝脏。因此，影响胆汁酸吸收、排出的因素都与肝损伤密切相关[18]。

中医药治疗疾病遵从辨证论治，结合中药的多成分、多靶点、多途径特点，在胆汁淤积治疗方面具有显著优势。黄肝煎液由茵陈、当归、黄芩、黄柏、大黄及龙胆等方药组成，方中重用茵陈清热利湿、退黄疸，配黄芩、黄柏清热燥湿而解毒疫，佐大黄疏肝利胆，祛除湿热毒邪。山药、川楝子行气补脾虚证；龙胆草、茯苓，前者苦寒直泄，后者平甘渗湿，两药合用，泻肝胆实火，利水渗湿，除下焦湿热；郁金行气散肝郁，利胆退黄。诸药合用，具有清热利湿、利胆退黄之功效，切中“胆汁淤积”的病机。

本研究使用ANIT 诱导大鼠后，胆汁流量明显减少，血清胆汁重要成分TBA 和TBIL 水平显著上升，肝损伤指标ALT、AST、ALP 及Hyp 含量明显升高；HE 染色结果亦提示肝脏组织大量炎性细胞浸润，肝细胞脂肪变性、脂肪空泡、坏死明显，均表明肝内胆汁淤积肝损伤大鼠模型成功建立。黄肝煎液能够逆转ANIT 诱导的血清ALT、AST 和ALP 升高，降低血清TBA、TBIL 水平，提高胆汁流量，明显改善肝脏病理改变，表明其对ANIT 诱导的胆汁淤积肝损伤具有一定保护作用，但其对胆汁酸合成、代谢、转运及排泄相关环节的影响及具体作用机制需进一步深入研究。

本研究进一步通过小鼠急性毒性试验观察黄肝煎液的用药安全性。黄肝煎液临床成人日用剂量是2.445 g·kg-1，而在本急性毒性试验中，以最大给药浓度1.63 g·mL-1，最大给药体积40 mL·kg-1灌胃小鼠，24 h 内给予黄肝煎液3次，最大日给药量为195.6 g·kg-1（相当于临床成人日用剂量的80 倍）时，连续观察14天，除部分小鼠体质量降低、稀便软便外，其余小鼠均未出现死亡和明显的急性毒性反应。提示该制剂在本研究最大给药剂量条件下，短期给药无明显毒性，但后期还应结合长期毒性实验进一步对其安全进行性评价，以全面保证临床用药的安全性。

综上所述，本研究明确了黄肝煎液对胆汁淤积性肝损伤的保护作用及初步安全性评价，为临床应用提供理论依据。