蒙药石龙芮的质量标准研究*

李润甜，渠 弼，莲 花，牧 丹，那生桑，白文明

（内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特 010110）

蒙药石龙芮为毛茛科植物石龙芮的全草，主要生长于潮湿地区、河（湖）边，甚至水中，全国各地均有分布。石龙芮的蒙药名称为乌热勒赫格-其其格，蒙医药古籍《认药白晶鉴》[1]、《金光注释集》[2]等均有记载。石龙芮具有破痞、调火、燥协日乌素、消肿、解毒等功效，主治消化不良、胃火衰败、胸膈痞满、虫痞、协日乌素病、痈疖、瘰疬等病症[3]。石龙芮含有毛茛苷、白头翁素、原白头翁素及黄酮类等多种活性成分[4-5]。经现代药理学研究证明，上述化学成分具有抗炎、镇痛、杀菌、抗病毒及抗毒性等活性，如：石龙芮所含黄酮苷类、内酯类成分及毛茛总苷等具有显著的抗炎镇痛作用[6]，白头翁素对葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、结核杆菌、大肠杆菌等具有较强的杀真菌活性的作用[7-8]，而且还具有一定的抗病毒及抗毒性作用[9]。石龙芮在蒙医临床上的广泛应用已经充分证明了石龙芮的药用价值，但是由于石龙芮质量控制体系的不健全，很大程度上限制了药材的正常流通和进一步研究开发工作。所以内蒙古自治区人民政府以内蒙古自治区科技厅和药检所为牵头单位，依托内蒙古医科大学的科研平台设立了多个蒙药材及炮制品质量标准研究项目，本研究为其中的重要组成部分。

目前石龙芮的质量控制标准研究基本处于空白阶段，既无系统的质量标准又无科学的研究案例，质量评价主要是以外观形状作为判断标准。为了提高石龙芮药材质量控制的准确度，本研究将从性状特征描述、显微和薄层鉴别、水分和灰分（酸不溶性灰分）限度检查、浸出物含量测定、药效成分含量测定等方面进行分析研究，为建立科学评价石龙芮药材药用价值的质量标准体系提供理论依据。

1 仪器与试药

TU-1901型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KSW-5-12型马弗炉（天津市中环实验电炉有限公司）；BX41-12P02型奥林巴斯生物显微镜（Olympus Corporation）；WD-9403E型紫外灯（北京六一生物科技有限公司）；DHG-9013A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

芦丁对照品（含量：92.6%，批号：100080-201610，中国食品药品检定研究院）；甲醇、乙醚、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸均为市售分析纯；水为自制去离子水。

7批石龙芮药材为2016—2017年于内蒙古各地区采集获得，经内蒙古医科大学药学院生药教研室渠弼副教授鉴定为毛茛科植物石龙芮Ranunculus sceleratus L.的全草。石龙芮药材来源信息见表1。

表1 石龙芮药材来源信息

2 方法及结果

2.1 性状 本品长10～60 cm，根须状，簇生，黄白色至黄棕色。茎扁圆柱形，直径2～5 mm，表面黄白色至黄绿色，具细纵棱，被稀疏柔毛，质脆，断面白色，纤维性，中空。叶多皱缩破碎，完整者叶片轮廓肾状圆形，长1～4 cm，宽1.5～5 cm，3深裂或3全裂，表面黄绿色或绿色，疏生柔毛，叶柄基部膜质扩大抱茎。聚伞花序，花小，直径4～8 mm，花冠5，黄色，花萼及花托被柔毛。聚合果矩圆形，长8～12 mm，瘦果卵圆形，稍扁，略偏斜，长约1 mm，表面具细皱纹，顶端具短喙，长约0.1～0.2 mm。气微，味淡。（见图1）

图1 石龙芮药材图

2.2 鉴别

2.2.1 显微鉴别 按照2020年版《中华人民共和国药典》（通则2001）显微鉴别法进行试验。

本品入药部位主要为茎、叶等器官，具体显微特征均在粉末片中可察见，故将本品粉末特征列入标准。本品茎下部黄白色，上部黄绿色，叶为绿色，随贮藏时间延长，颜色有所变浅，故粉末颜色暂定为黄绿色或灰绿色。

取本品不同批次的药材粉末，制作粉末片，置显微镜下观察，各批次结构基本一致。本品粉末黄绿色至灰绿色，上表皮细胞的细胞壁平直，下表皮细胞的细胞壁弯曲，气孔不定式，副卫细胞4～6个。非腺毛单细胞，稍弯曲。花粉粒类球形，表面具颗粒状雕纹，萌发孔3个，直径23～31 μm。木纤维直径12～20 μm，壁厚微木化。导管为螺纹、网纹、孔纹导管。不同批次的样品均呈阳性，所以将上述显微特征规定为石龙芮质量标准的显微鉴别标准。（见图2）

图2 石龙芮药材粉末的显微鉴别图

2.2.2 薄层鉴别 本品黄酮类化合物的含量较高且具有明显的药理活性，所以本研究选择黄酮类物质芦丁作为对照品，基于芦丁与三氯化铝的显色反应建立薄层鉴别方法。

取本品粉末2 g，加稀乙醇50 mL，加热回流1.5 h，放冷，滤过，滤液蒸至无醇味，加水10 mL，用石油醚（30～60 ℃）洗涤2次，每次20 mL，弃去石油醚液，水液加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯，蒸干，残渣加乙醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。另取芦丁对照品适量，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液，作为对照品溶液。按照2020年版《中华人民共和国药典》（通则0502）薄层色谱法进行试验，吸取上述两种溶液各2 μL，分别点于同一聚酰胺薄膜，以乙醇-丙酮-水（7∶5∶6）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，热风吹干，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，斑点分离清晰，鉴别效果满意。不同批次的样品均呈阳性，故将上述方法规定为石龙芮的薄层鉴别法。（见图3）

图3 芦丁鉴别的薄层色谱图

2.3 检查

2.3.1 水分 取各批次石龙芮粉末约3.0 g，精密称定，按照2020年版《中华人民共和国药典》（四部）（通则0832）水分测定法的第二法（烘干法）进行测定，每批样品重复测定3次，计算平均值。结果：7批次石龙芮的水分含量范围为8.28%～10.9%，平均含量为9.53%。（见表2）

表2 7 批次石龙芮中水分、水溶性浸出物、总灰分和酸不溶性灰分含量测定结果

2.3.2 总灰分、酸不溶性灰分 取各批次石龙芮粉末约3.0 g，精密称定，按照2020年版《中华人民共和国药典》（四部）（通则2302）灰分测定法进行测定，每批样品重复测定3次，计算平均值。结果：7批次石龙芮中总灰分含量范围为7.85%～10.30%，平均含量为9.09%，酸不溶性灰分含量范围为1.95%～4.16%，平均含量为3.13%。（见表2）

2.4 浸出物含量 取各批次石龙芮粉末约4.0 g，精密称定，本研究按照2020年版《中华人民共和国药典》（通则2201）浸出物测定法（冷浸法）对各批次石龙芮药材的浸出物进行测定，每批样品重复测定3次，计算平均值。结果：7批样品浸出物含量在19.64%～25.04%，平均含量为21.84%。（见表2）

2.5 总黄酮含量测定

2.5.1 供试品溶液的制备 取本品粗粉约1.0 g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚适量，加热回流至提取液无色（10 min虹吸1次，约需要2 h），放冷，弃去乙醚液。再加甲醇90 mL，加热回流至提取液无色，转移至100 mL量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取3.0 mL，置25 mL量瓶中，加水至7.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，即得。

2.5.2 对照品溶液的制备 取芦丁对照品25 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含芦丁0.2 mg）。

2.5.3 线性关系考察 精密量取“2.5.2”项下对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL，分别置25.0 mL量瓶中，各加水至7.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10.0 mL，再加水至刻度，摇匀，放置15 min，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（通则0401），在508 nm波长处依次测定芦丁标准溶液的吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。结果，标准工作曲线的线性回归系数r=0.999 7，回归方程为Y=99.97X-0.536 7，表明总黄酮含量在0.00～57.57 μg/mL范围内，呈良好的线性关系。

2.5.4 精密度试验 按照“2.5.1”方法制得供试品溶液1份，依法连续测定6次，测得吸光度值。结果显示，吸光度值的RSD为0.64%，表明仪器精密度良好。

2.5.5 稳定性试验 按照“2.5.1”方法制得供试品溶液1份，分别于制得的0、1、2、4、6、8 h后，依法进行测定。结果显示，吸光度值的RSD为0.48%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.5.6 重复性试验 称取同一批次（批号：20170608）样品粉末6份，每份约1 g，精密称定，按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液，依法分别测定其吸光度值，采用标准曲线法计算总黄酮含量。结果显示，总黄酮的平均含量为36.8 mg/g，RSD为1.68%，表明此法重复性良好。

2.5.7 加样回收率试验 称取同一批次样品（批号：20170608）粉末6份，每份约0.5g，精密称定，按芦丁对照品加入量与所取供试品中总黄酮含量之比1.5∶1.0、1.0∶1.0、0.5∶1.0加入芦丁对照品，每一个比例平行2份，按照供试品溶液制备方法制得供试品溶液，依法测定其吸光度并计算加样回收率。结果显示，高、中、低比例供试品溶液中总黄酮的平均加样回收率分别为97.69%、96.87%、98.48%，RSD分别为4.06%、0.66%、0.47%（n=3），表明此方法的准确度良好。（见表3）

表3 加样回收率试验结果 （n=2）

2.5.8 各批次样品的总黄酮含量测定 取各批次样品，按照“2.5.1”方法分别制得供试品溶液3份，依法测定总黄酮含量，分别计算各批次样品总黄酮含量的平均值。结果显示，编号1～7的石龙芮样品的平均总黄酮含量分别为36.8、37.0、36.0、35.9、35.2、36.8、38.2 mg/g。

3 讨论

3.1 药材性状、显微鉴别与检查 本研究于不同产地、不同年度采集获得7批次石龙芮样品。各批次样品间外观、形状无明显差异，各项植物性状特征与蒙医药典籍[3]所描述的一致。现行的石龙芮药材鉴别手段主要是基于外观性状特征的分析方法，不仅方法专属性弱而且对鉴别人员的专业知识储备和经验要求较高，不适合于大范围普及。本研究在系统归纳总结7批次石龙芮药材茎、叶等器官的植物组织显微特征的基础上，制定了科学合理的显微鉴别标准。

石龙芮药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分及浸出物含量可作为检查项对药材储存保管、运输流通过程中杂质混入和掺假等问题进行有效的监控[10]，但至今未见任何有关文献报道，所以本研究对石龙芮药材中的上述检查项进行了测定。结果显示，7批次石龙芮样品中平均水分含量为9.53%，平均总灰分含量为9.09%，平均酸不溶性灰分含量为3.13%，平均水溶性浸出物含量为21.84%。制定上述检查项限度值的过程中，需结合不同地区的自然环境、行业需求等制定出符合实际情况的质量标准。

3.2 薄层鉴别与含量测定 药效或指标成分的理化鉴别和含量测定是在上述鉴别和检查手段的基础上进一步保证药材品质的重要质量控制环节。黄酮类化合物是石龙芮药材的重要次生代谢产物，经现代药理学研究证明黄酮类化合物具有抗炎、抑菌、抗肿瘤、降血糖、抗氧化等多种药理作用[11-13]。石龙芮中含有的黄酮类化合物种类多且含量变化范围宽，是石龙芮药材发挥药效的物质基础。所以，石龙芮总黄酮的含量测定对保证药材品质和临床疗效有重要的意义。芦丁分子含有两个共轭体系，是黄酮类化合物的典型结构，即邻苯二酚，可作为石龙芮药材质量控制环节中重要的指标成分[14-17]。本研究在参考毛茛科其他药材的文献报道和药典收载的薄层鉴别和总黄酮含量测定方法的基础上，经实验研究建立了基于芦丁的薄层色谱鉴别方法和总黄酮含量测定方法。

本研究经实验研究确定了薄层色谱鉴别方法的提取工艺、展开剂种类及配比、显色条件等，并对各批次样品进行了薄层鉴别分析。7批次石龙芮样品的供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显示相同颜色的斑点。在对总黄酮含量进行测定时，虽然黄酮类成分在紫外区有吸收，但是石龙芮的化学成分复杂，会对总黄酮的测定产生干扰，所以本研究采用具有较高选择性的显色方法，即先用亚硝酸钠还原黄酮类成分，再加硝酸铝与之络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类成分开环，生成2-羟基查尔酮从而显色，显色后对总黄酮含量进行定量分析。

在确定了供试品溶液和对照品溶液制备方法的基础上，经方法学考察试验证明总黄酮含量测定方法在0.00～57.57μg/mL范围内回归系数r=0.999 7，连续测量6次的吸光度RSD=0.64%，供试品溶液制备后8 h内吸光度的RSD=0.48%，平行取样6份测得的总黄酮含量的RSD=1.68%，3种不同比例加样回收试验的平均加样回收率分别为97.69%、96.89%、98.48%，表明此方法可用于对石龙芮中总黄酮含量进行含量测定。按所建立的含量测定方法对7批次石龙芮药材进行了总黄酮含量测定，结果显示各批次石龙芮药材中总黄酮含量无明显差异，平均含量为36.6 mg/g。在制定含量标准时，应充分考虑不同自然环境、生长年份、采摘季节等因素的影响，制定出符合实际需求的质量标准。

现代分析测试技术在传统蒙药材质量标准中的应用研究不仅能提高药材质量控制的准确度和精密度，同时也是提高蒙药相关产品质量控制现代化程度的技术基础。本研究建立的石龙芮质量标准快速简便，且准确度高，可作为药材流通或制剂过程中质量控制的标准方法。本标准的建立不仅对完善蒙药石龙芮的质量标准体系具有重要的理论指导意义，也可以为其他植物类药物质量标准的建立提供参考。