健脾柔肝息风汤联合针刺对抽动障碍模型大鼠纹状体区细胞自噬及凋亡的影响

张南， 朱沁泉， 何炜星， 李博， 廖艳红

（湖南中医药大学第一附属医院张涤中医儿科临床研究所，湖南长沙 410007）

抽动障碍（tic disorder）是一种起病于儿童和青少年时期的精神障碍疾病，以运动性或发声性抽动为主要的临床症状[1]。相关研究[2]表明，抽动障碍病理生理学和临床症状之间的联系可能在于皮质-纹状体-丘脑-皮质（CSTC）回路。纹状体作为大脑基底神经节之一，主要负责调节肌肉张力和各种精细复杂的运动[3]。研究指出，纹状体受损可导致纹状体神经元凋亡[4]，引起抽动行为[5]，而提高纹状体自噬会改善运动性功能障碍[6]。张涤教授根据多年临床治疗抽动障碍的经验，研制了健脾柔肝息风汤。目前，该汤剂在本院广泛应用于儿童抽动障碍治疗，取得了良好的疗效[7]。课题组前期进行抽动障碍动物模型研究[8]发现，健脾柔肝息风汤可以通过调节脑皮质和纹状体多巴胺能神经系统功能平衡减轻抽动障碍大鼠脑皮质和纹状体损伤，改善抽动症状。而针刺作为中医特色外治法，亦能显著改善儿童抽动障碍的抽动症状[9]，已广泛应用于临床。既往吴灵芝等[10]临床研究表明，中药复方配合针刺太冲、三阴交、足三里、神门、内关、合谷、百会、风池等穴位可显著改善多发性抽动症状，降低复发率。因此，本研究在健脾柔肝息风汤治疗基础上辅以针刺疗法治疗抽动障碍大鼠，探讨其治疗作用及机制，以期为临床应用提供更多的选择方案，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF 级SD 大鼠60 只，雌雄各半，鼠龄4 周，体质量80 ～100 g， 由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2021-0002。动物饲养于湖南中医药大学第一附属医院创新实验中心动物房，动物使用许可证号：SYXK（湘）2020-0010。动物饲养环境为温度22 ～24 ℃、相对湿度50% ～60%，明暗光照各12 h。动物实验过程严格按照《实验动物管理条例》执行，并获得本院动物伦理委员会的批准（审批号：IACUC20210047）。

1.2 药物健脾柔肝息风汤中药组成：钩藤10 g，全蝎6 g，僵蚕10 g，白芍10 g，茯苓10 g，甘草2 g。中药材均购自亳州市惠苍药业销售有限公司。按照《中华人民共和国药典》要求制备煎剂，浓缩至生药含量为1.2 g/mL，于冰箱冷藏备用，由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供。

1.3 试剂亚氨基二丙腈（IDPN，上海Aladdin 公司生产，纯度98%）；末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色试剂盒和二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒（武汉塞维尔生物技术有限公司）；兔多克隆Bcl-2 抗体、兔单克隆Bax 抗体、兔单克隆Beclin1 抗体、山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗和兔抗小鼠IgG 二抗（英国Abcam 公司）；兔单克隆cleaved-caspase-3 抗体、小鼠单克隆LC3抗体和GAPDH抗体（美国CST公司）。

1.4 仪器无菌针灸针（苏州医疗用品厂有限公司，型号： 0.30 mm×40 mm）；酶标仪（美国Rayto公司，型号：RT-6100）；电泳仪（北京六一仪器厂，型号：DYY-6C）；正置白光拍照显微镜（日本Olympus公司，型号：CX31）；透射电子显微镜（日本HITACHI 公司，型号：HT7700）；超薄切片机（德国Leica公司，型号：UC7）。

1.5 抽动障碍模型构建与分组将60 只SD 大鼠随机分为空白组（12 只）和造模组（48 只），组内大鼠雌雄各半。造模组大鼠给予腹腔注射IDPN 溶液（150 mg·kg-1·d-1），空白组大鼠给予腹腔注射等体积0.9%氯化钠溶液，连续注射1周[11]。按Diamond评分标准[12]进行评分。运动行为评分：安静或正常运动，计0 分；过度兴奋，计1 分；探究行为增加并伴有不连续吸鼻，计2 分；不停跑动，计3 分；不停跑动伴有惊跳，计4分。刻板行为评分：无刻板行为，计0 分；躯体旋转行为，计1 分；头颈部疯狂出现上下运动，计2分；头颈部的上下运动加旋转行为，计3分；头向侧摆并伴有头颈部的上下运动跳，计4分。评估大鼠行为学表现，以≥1 分为造模成功。将造模成功的抽动障碍大鼠，随机分为模型组、健脾柔肝息风汤组（以下简称汤剂组）、针刺组和健脾柔肝息风汤联合针刺组（以下简称联合组），每组12只。

1.6 给药干预本课题组前期多次进行动物实验摸索健脾柔肝息风汤剂量，确定12.0 g·kg-1·d-1治疗效果最佳。本研究造模成功后第3 天，汤剂组大鼠于每日上午10∶00 给予健脾柔肝息风汤12.0g·kg-1·d-1灌胃，连续6周；而空白组、造模组和针刺组大鼠给予等体积蒸馏水灌胃。针刺组根据中国针灸学会发布的《实验动物常用穴位名称与定位第2 部分：大鼠》中穴位定位，选取太冲、三阴交、足三里、神门、内关、合谷、百会、风池等穴位进行针刺：毫针快速刺入皮下，且与皮肤呈垂直状，缓缓捻入，深度为0.6 cm，有滞紧感后快速捻转160 次/min，上下提插，幅度180°～360°，行针1 min 后留针30 min，然后出针。每日1 次，连续6 次，休息1 d 为1 个疗程，共6 个疗程[13]。联合组大鼠按照上述方法给予健脾柔肝息风汤灌胃联合针刺治疗。

1.7 观察指标与方法

1.7.1 大鼠行为学评价 分别于造模后、药物干预结束后当天进行各组大鼠行为学评价。将单只大鼠放置于透明的观察笼中，处于安静、避光的环境，于笼内适应5 min，并监控记录5 min 活动，单只观察完毕后，酒精清理笼内排泄物及气味。由2 人分别观察影像，参考Diamond 评分标准[12]进行双盲评分。

1.7.2 样本采集 最后一次行为学评价结束后采用二氧化碳吸入法处死各组大鼠，迅速摘取脑组织，于冰盒上分离纹状体。各组取6只大鼠左侧纹状体放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于苏木素-伊红（HE）染色和TUNEL 染色，右侧纹状体（尺寸：1 mm × 1 mm × 1 mm 正方体）放入电镜固定，溶液中固定用于透射电镜分析；各组剩余6只大鼠左右侧纹状体取出后于-80 ℃冰箱中保存，用于Western Blot检测。

1.7.3 HE 染色法观察纹状体病理形态 将已固定好的左侧纹状体组织制成石蜡切片（厚3 μm），经脱蜡至水后，苏木素染核，盐酸分化，氨水返蓝，伊红染浆，脱水封片，于显微镜下观察纹状体病理形态特点。

1.7.4 TUNEL 染色法观察纹状体内细胞凋亡 将纹状体石蜡切片脱蜡至水，滴加蛋白酶K 工作液进行修复，磷酸缓冲液（PBS）洗涤，滴加破膜工作液，室温孵育20 min，PBS 洗涤。切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育20 min，PBS 洗涤，滴加Buffer 常温孵育10 min。加反应液，切片平放于湿盒内，37 ℃温箱孵育1 h，加Streptavidin-HRP 反应液，37 ℃温箱孵育30 min。滴加新鲜配制的3，3’-二氨基联苯胺（DAB）显色液，显微镜下控制显色时间，阳性凋亡细胞核呈棕黄色，纯水冲洗切片终止显色。苏木素复染细胞核，纯水洗涤，分化液分化，氨水返蓝，二甲苯透明，中性树胶封片。于显微镜下观察拍照，同时随机选取5个视野，统计纹状体内细胞凋亡数目，计算细胞凋亡率，细胞凋亡率（%）=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.7.5 透射电镜（TEM）观察纹状体自噬体形态将右侧纹状体组织放入由低到高梯度酒精中脱水，渗透包埋，包埋样本放于60 ℃烤箱聚合48 h，取出样本于超薄切片机制成70 nm 超薄切片，150 目方华膜铜网捞片，于2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色8 min，70%酒精清洗3 次，超纯水清洗3次；2.6%枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色8 min，超纯水清洗3次；滤纸稍吸干，室温干燥过夜。于透射电镜下观察纹状体组织自噬体形态。

1.7.6 Western Blot 法检测纹状体中相关蛋白表达 将纹状体裂解后提取蛋白质，采用BCA 蛋白定量检测试剂盒测定蛋白质浓度。上样30 μg 蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE），电转至硝酸纤维素膜，封闭， 加入按体积比稀释的一抗Bcl-2 抗体（1∶1 000）、Bax 抗体（1∶1 000）、cleaved-caspase-3 抗体（1∶1 000）、LC3抗体（1∶1 000）、Beclin1抗体（1∶1 000）和内参GAPDH（1∶10 000）4 ℃过夜孵育，TBST 洗涤3次，加入按照体积比1∶10 000稀释的与一抗同种属的二抗室温孵育2 h，TBST 洗涤3 次，滴加新鲜配制的增强化学发光试剂（ECL）进行充分反应，显影、定影。将胶片进行扫描存档，使用Alpha 软件处理系统分析目标带的光密度值，计算目的蛋白的相对表达量，目的蛋白的相对表达量=目的蛋白的光密度值/内参蛋白的光密度值。

1.8 统计方法采用SPSS 19.0统计软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠运动及刻板行为评分比较表1 结果显示：造模后，与空白组比较，其余4 组（即为造模组）大鼠运动及刻板行为评分显著升高（均P＜0.05）。药物干预结束后，与空白组比较，模型组大鼠运动及刻板行为评分显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，汤剂组、针刺组和联合组大鼠运动及刻板行为评分显著降低（P＜0.05）；联合组大鼠运动及刻板行为评分显著低于汤剂组或针刺组（P＜0.05）；汤剂组大鼠运动及刻板行为评分低于针刺组，但差异无统计学意义（P＞0.05）

表1 各组大鼠运动及刻板行为评分比较Table 1 Comparison of motor and stereotyped behavior scores in each group of rats（±s，分）

表1 各组大鼠运动及刻板行为评分比较Table 1 Comparison of motor and stereotyped behavior scores in each group of rats（±s，分）

注：①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与汤剂组比较；④P＜0.05，与针刺组比较

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2.2 各组大鼠纹状体病理学变化比较图1 结果显示：空白组大鼠纹状体细胞呈圆形，排列紧密有序，间质清晰；模型组大鼠纹状体组织疏松，细胞肿胀，呈不规则形状，部分细胞出现固缩性坏死，细胞数量明显减少，排列混乱。与模型组比较，汤剂组和针刺组大鼠纹状体细胞损伤程度有所改善，固缩性坏死和细胞肿胀等情况减少，细胞间隙明显紧密；与汤剂组或针刺组比较，联合组大鼠纹状体细胞趋于正常。结果表明，联合组治疗效果最佳。

图1 各组大鼠纹状体病理学变化比较（HE染色，×100）Figure 1 Comparison of pathological changes in the striatum in each group of rats（HE staining，×100）

2.3 各组大鼠纹状体细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达比较图2、图3 和表2 结果显示：与空白组比较，模型组大鼠纹状体细胞凋亡率显著升高（P＜0.05），Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，汤剂组、针刺组和联合组大鼠纹状体细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Bax和cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；与汤剂组或针刺组比较，联合组大鼠纹状体细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Bax 和cleaved-caspase-3蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），而Bcl-2 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；汤剂组大鼠纹状体细胞凋亡率和凋亡相关蛋白Bax、cleaved-caspase-3、Bcl-2 表达水平与针刺组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组大鼠纹状体细胞凋亡水平（TUNEL法，×200）Figure 2 Levels of apoptosis in striatal cells in each group of rats（TUNEL method，×200）

图3 各组大鼠纹状体中Bcl-2、Bax和cleavedcaspase-3蛋白的Western Blot 电泳条带图Figure 3 Western Blot electrophoresis band of Bcl-2，Bax and cleaved-caspase-3 in the striatum of each group of rats

表2 各组大鼠纹状体细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达比较Table 2 Comparison of apoptosis and apoptosis-related proteins expressions in striatal cells in each group of rats（±s）

表2 各组大鼠纹状体细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达比较Table 2 Comparison of apoptosis and apoptosis-related proteins expressions in striatal cells in each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，与空白组比较；②P＜0.05，与模型组比较；③P＜0.05，与汤剂组比较；④P＜0.05，与针刺组比较

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2.4 各组大鼠纹状体组织自噬体形态变化比较图4结果显示：空白组大鼠纹状体细胞正常，核膜光滑且完整连续，双层结构清晰可见，核内染色质分布均匀；模型组大鼠纹状体细胞呈不规则形状，核膜粗糙且不连续，出现锯齿样，双层结构混乱，部分胞质内出现自噬体。与模型组比较，汤剂组和针刺组大鼠纹状体不规则形状细胞减少，自噬体数量增多，且汤剂组的自噬水平略高于针刺组；与汤剂组或针刺组比较，联合组大鼠纹状体细胞趋于正常，核膜较光滑完整，出现大量的自噬体。表明联合组治疗效果最佳。

图4 各组大鼠纹状体组织自噬体形态图（透射电镜，蓝色箭头指示自噬体）Figure 4 Morphological features of autophagosomes in striatal tissue of each group of rats（under TEM，blue arrows indicate autophagosomes）

2.5 各组大鼠纹状体中自噬相关蛋白LC3 和Beclin1 蛋白表达比较图5、表3 结果显示：与空白组比较，模型组大鼠纹状体中LC3 和Beclin1 蛋白表达水平无显著性差异（P＜0.05）；与模型组比较，汤剂组、针刺组和联合组大鼠纹状体中LC3和Beclin1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）；联合组大鼠纹状体中LC3 和Beclin1 蛋白表达水平显著高于汤剂组和针刺组（P＜0.05）。LC3 和Beclin1 参与自噬体的形成，均为重要的自噬标志性分子，LC3表达水平可判断自噬是被诱导还是被抑制，而Beclin1 可评估自噬活性的强弱程度[14]。结果表明，正常情况下（空白组）纹状体自噬水平很低，而纹状体病理生理状态下（模型组），部分自噬被激活，但不显著；健脾柔肝息风汤和针刺在纹状体病理状态下均能激活自噬，其中健脾柔肝息风汤联合针刺引起的自噬水平最高。

图5 各组大鼠纹状体中LC3和Beclin1蛋白的Western Blot电泳条带图Figure 5 Western Blot electrophoresis bands of LC3 and Beclin1 proteins in the striatum of each group of rats

表3 各组大鼠纹状体中LC3和Beclin1蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of protein expression levels of LC3 and Beclin1 in the striatum of each group of rats（±s）

表3 各组大鼠纹状体中LC3和Beclin1蛋白表达水平比较Table 3 Comparison of protein expression levels of LC3 and Beclin1 in the striatum of each group of rats（±s）

注：①P＜0.05，与模型组比较；②P＜0.05，与汤剂组比较；③P＜0.05，与针刺组比较

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3 讨论

抽动障碍是一种神经发育障碍性疾病。抽动障碍发展机制尚不明确，但控制运动和行为的CSTC 回路在其进展中起关键作用[15]。有研究[15-16]表明，纹状体是CSTC 回路的主要调节元件，在抽动障碍疾病中具有核心作用。Makki 等[17]研究发现，儿童纹状体的微观结构异常会加重抽动障碍。本研究通过腹腔注射IDPN 构建抽动障碍大鼠模型，结果发现：抽动障碍大鼠纹状体内部分自噬被激活，但不显著；细胞凋亡水平增加，纹状体受损严重，运动及刻板行为评分升高，出现明显的抽动症状。尽快阻断上述病理进程、保护纹状体细胞是改善抽动障碍抽动的关键。本研究单用健脾柔肝息风汤或针刺对抽动障碍大鼠抽动症状均有改善作用，表现为提高大鼠纹状体自噬水平，降低纹状体细胞凋亡水平，改善纹状体损伤从而减轻抽动症状。

健脾柔肝息风汤以白芍、茯苓为君，钩藤、僵蚕、全蝎为臣，以甘草调和，共奏健脾化痰、柔肝养阴息风之效。本课题组前期实验研究[18-19]结果显示，健脾柔肝息风汤对抽动障碍大鼠的运动性抽动行为有良好的缓解作用，主要通过降低脑组织多巴胺受体1、2 表达及调节多巴胺能系统及代谢产物平衡。本研究结果表明，健脾柔肝息风汤可有效改善抽动障碍大鼠抽动症状，其主要是通过调节纹状体区细胞自噬和凋亡水平发挥作用。

近年来，针刺在治疗抽动障碍方面具有积极的临床疗效[20]。本研究选取百会（督脉）、神门（手少阴心经）、风池（足少阳胆经）、内关（手厥阴心包经）、合谷（手阳明大肠经）、足三里（足阳明胃经）、太冲（足厥阴肝经）、三阴交（足太阴脾经）等穴位。取百会为治疗抽动障碍要穴，太冲、三阴交、足三里、神门、内关、合谷、风池为常用重要的腧穴，共奏醒神开窍、安神定志、通督定痫的效果[20-22]。本研究结果显示，健脾柔肝息风汤联合针刺对抽动障碍大鼠的治疗效果较单用健脾柔肝息风汤或针刺治疗更加显著，表明健脾柔肝息风汤联合针刺治疗，在各自发挥作用的同时相辅相成。

自噬是一种维持正常细胞活动的蛋白降解方式。对多种神经疾病模型大鼠纹状体进行分析的结果显示，纹状体区细胞自噬水平提高可改善纹状体损伤，缓解运动障碍[23-24]。自噬具有十分复杂的调控机制，许多蛋白参与其中，其中Beclin1 和LC3 是与自噬相关的关键蛋白[25]。研究[26-27]表明，纹状体内Beclin1 和LC3 蛋白高表达，可引起自噬激活，从而减轻纹状体神经元损伤和运动障碍。研究[27-28]还发现，Beclin1 可介导凋亡与炎症机制，具有抗凋亡作用。Wang 等[29]研究显示，失调的自噬途径会导致脑内神经元凋亡，使脑内抗凋亡蛋白Bcl-2下调和促凋亡蛋白Bax、cleaved-caspase-3上调。本研究结果显示，抽动障碍大鼠纹状体中Bax 和cleaved-caspase-3 蛋白高表达，而Bcl-2 蛋白低表达，Beclin1 和LC3 蛋白差异不显著，细胞凋亡率升高，纹状体受损明显；经健脾柔肝息风汤联合针刺干预后，抽动障碍大鼠纹状体中Bax和cleaved-caspase-3 蛋白低表达，而Bcl-2、Beclin1 和LC3 蛋白高表达。提示联合治疗通过激活纹状体内大量细胞自噬，抑制细胞凋亡，从而减轻纹状体损伤。

综上所述，健脾柔肝息风汤辅以针刺治疗可提高抽动障碍大鼠纹状体区细胞自噬水平，并抑制细胞凋亡，改善抽动障碍大鼠纹状体损伤，从而缓解抽动症状。本研究为临床联合应用健脾柔肝息风汤和针刺治疗抽动障碍提供了依据。