肠道菌群易位与老年糖尿病患者发生主要不良心血管事件的关系研究

陆水英，汤之明，陈力行，刘琳

糖尿病是心血管疾病的主要危险因素，而心血管疾病是老年糖尿病患者最常见的死亡原因［1］。因此，阐明老年糖尿病患者发生心血管事件的病理生理学机制及寻找新的生物标志物或靶点十分必要。研究表明，肠道微生物群可参与慢性病（如炎症性肠病、肝硬化、关节炎和2型糖尿病）的发生发展［2］，如紊乱的肠道微生物群与大鼠心肌梗死易感性有关［3］。此外，从肠腔逸出的微生物代谢产物三甲胺N-氧化物（trimethylamine N-oxide，TMAO）进入体循环后可通过触发单核细胞募集而激活免疫炎症反应［4］。但少有研究探讨肠道菌群及其代谢产物在糖尿病心血管事件中的作用。本研究假设糖尿病导致机体肠道屏障功能衰竭和肠道黏膜通透性增加，促使肠道细菌及其代谢产物易位进入全身循环，从而过度激活免疫炎症反应并增加患者心血管事件发生风险。为此，本研究招募了50例健康对照者和100例老年糖尿病患者，通过宏基因组测序分析其全身微生物组，进而分析肠道菌群易位与老年糖尿病患者发生主要不良心血管事件（major adverse cardiac events，MACE）的关系，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2019年1月至2021年1月在肇庆市第一人民医院治疗的100例老年糖尿病患者作为研究对象，其均接受至少6个月的降血糖治疗。根据随访期间患者是否发生MACE将其分为MACE（+）组23例和MACE（-）组77例。另选取同期在肇庆市第一人民医院接受健康体检的非糖尿病者50例作为对照组。本研究经肇庆市第一人民医院伦理委员会审查通过（伦审2018-055-03），所有受试者签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准：（1）年龄≥65岁；（2）临床资料完整。排除标准：合并肿瘤等严重疾病或严重外伤者。

1.3 观察指标 （1）全身微生物组多样性指标。使用十六烷基三甲基溴化铵法从三组受试者血液样本中提取基因组DNA，然后将基因组DNA稀释至1 ng/μl作为模板，以16 S V4区域作为靶标进行扩增。引物序列：515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）和806R（5'-GGACTCHVGGGTWTCTAAT-3'）。使用Phusion High-Fidelity PCR Master Mix进行PCR，通过Thermo Scientific试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）将PCR产物进行纯化。使用Thermo Fisher Scientific公司生产的Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建库试剂盒构建DNA文库，并进行Qubit定量和文库测试，然后使用Ion S5TM或Ion S5TMXL测序平台进行测序。使用Cutadapt V1.9.1软件获得原始数据，然后再进行质控过滤以获得有效数据。使用UPARSE软件对所有有效碱基进行操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）聚类分析。采用QIIME 1.9.1软件计算血液样本的OUT总数和香农指数，使用R软件进行主坐标分析以挖掘三组受试者血液细菌特征的差异。（2）血浆肠道菌群百分比。记录三组受试者血浆肠道菌群百分比。（3）收集MACE（+）组和MACE（-）组患者临床资料、实验室检查指标及左心室射血分数（left ventricle ejection fraction，LVEF），其中临床资料包括性别、年龄、BMI、吸烟情况、高血压发生情况及用药情况，实验室检查指标包括空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、白细胞计数、单核细胞计数、估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、超敏C反应蛋白（high-sensitivity C-reactive protein，hs-CRP）、CD14+CD16+单核细胞计数及血浆TMAO、D-乳酸。并计算ΔCD14+CD16+单核细胞计数、ΔTMAO、ΔD-乳酸，以反映CD14+CD16+单核细胞计数、TMAO、D-乳酸变化情况，ΔCD14+CD16+单核细胞计数=CD14+CD16+单核细胞计数发病第2天-CD14+CD16+单核细胞计数发病第1天，ΔTMAO=TMAO发病第2天-TMAO发病第1天，ΔD-乳酸=D-乳酸发病第2天-D-乳酸发病第1天。然后基于ΔTMAO和ΔD-乳酸构建一个新的变量——Z评分，首先计算ΔTMAO和ΔD-乳酸的Z分数，计算公式：Z分数 = （x-μ）/σ，其中x为需要标准化的原始分数，μ为平均值，σ为标准偏差，然后将ΔTMAO和ΔD-乳酸Z分数的平均值作为Z评分。

1.4 随访 所有患者进行电话随访和门诊随访，主要终点事件为MACE（包括急性非致死性心肌梗死、急性缺血性脑卒中、心源性死亡及血运重建），随访截止时间为2022年3月。

1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组间比较采用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验；不符合正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验；计数资料比较采用χ2检验；ΔTMAO、ΔD-乳酸与ΔCD14+CD16+单核细胞计数的相关性分析采用Spearman秩相关分析；老年糖尿病患者发生MACE的影响因素分析采用多因素Cox比例风险回归分析，绘制ROC曲线以评估ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z评分及Z评分+hs-CRP+CD14+CD16+单核细胞计数对老年糖尿病患者发生MACE的预测价值。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组、MACE（-）组及MACE（+）组全身微生物组多样性指标和血浆肠道菌群百分比 对照组、MACE（-）组及MACE（+）组OTU总数、香农指数及血浆肠道菌群百分比比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；MACE（+）组OTU总数、香农指数及血浆肠道菌群百分比均高于对照组和MACE（-）组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。主坐标分析结果显示，MACE（+）组血液细菌特征与对照组或MACE（-）组明显分开（P值均 ＜ 0.001），见图1。

图1 三组血液细菌特征的主坐标分析结果Figure 1 Results of principal coordinate analysis of three groups of blood bacterial characteristics

表1 对照组、MACE（-）组及MACE（+）组OTU总数、香农指数及血浆肠道菌群百分比比较（±s）Table 1 Comparison of total number of OTU，Shannon index and percentage of plasma intestinal flora in control group，MACE（-）group and MACE（+）group

表1 对照组、MACE（-）组及MACE（+）组OTU总数、香农指数及血浆肠道菌群百分比比较（±s）Table 1 Comparison of total number of OTU，Shannon index and percentage of plasma intestinal flora in control group，MACE（-）group and MACE（+）group

注：MACE=主要不良心血管事件，OTU=操作分类单元；a表示与对照组比较，P＜0.05；b表示与MACE（-）组比较，P＜0.05

组别例数OTU总数香农指数血浆肠道菌群百分比（%）对照组501 488±1042.62±0.268.26±0.54 MACE（-）组771 105±1322.41±0.228.42±0.35 MACE（+）组231 587±140ab3.26±0.28ab10.77±0.61ab F值3.1463.3154.035 P值0.0290.0200.005

2.2 MACE（-）组和MACE（+）组临床资料、实验室检查指标及LVEF比较 MACE（-）组和MACE（+）组女性占比、年龄、BMI、吸烟率、高血压发生率、空腹血糖、总胆固醇、三酰甘油、白细胞计数、单核细胞计数、eGFR及胰岛素、口服降糖药、阿司匹林、他汀类药物、钙通道阻滞剂、ACEI/ARB使用率比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；MACE（+）组hs-CRP、CD14+CD16+单核细胞计数、TMAO、D-乳酸、ΔCD14+CD16+单核细胞计数、ΔTMAO、ΔD-乳酸及Z评分高于MACE（-）组，LVEF低于MACE（-）组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 MACE（-）组和MACE（+）组临床资料、实验室检查指标及LVEF比较Table 2 Comparison of clinical data，laboratory examination indexes and LVEF between MACE（-）group and MACE（+）group

2.3 老年糖尿病患者发生MACE影响因素的多因素Cox比例风险回归分析 将老年糖尿病患者是否发生MACE（赋值：否=0，是=1）作为因变量，排除存在多重共线性的指标后，将hs-CRP（赋值：＞2.64 mg/L=1，≤2.64 mg/L=0）、CD14+CD16+单核细胞计数（赋值：＞25.8细胞/μl=1，≤25.8细胞/μl=0）、Z评分（赋值：＞0.71=1，≤0.71=0）、LVEF（赋值：＞50%=0，≤50%=1）作为自变量，采用向前逐步选择法，进行多因素Cox比例风险回归分析，结果显示，hs-CRP、CD14+CD16+单核细胞计数、Z评分是老年糖尿病患者发生MACE的独立影响因素（P＜0.05），见表3。

表3 老年糖尿病患者发生MACE影响因素的多因素Cox比例风险回归分析Table 3 Multivariate Cox proportional hazard regression analysis of influencing factors of MACE in elderly patients with diabetic mellitus

2.4 ROC曲线 ROC曲线分析结果显示，ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z评分、Z评分+hs-CRP+CD14+CD16+单核细胞计数预测老年糖尿病患者发生MACE的AUC分别为0.647〔95%CI（0.533，0.761）〕、0.630〔95%CI（0.527，0.725）、0.681〔95%CI（0.567，0.794）、0.822〔95%CI（0.738，0.906），见表4。

表4 ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z评分及Z评分+hs-CRP+CD14+CD16+单核细胞计数对老年糖尿病患者发生MACE的预测价值Table 4 Predictive value of ΔTMAO，ΔD-lactic acid，Z score and Z score+hs-CRP+CD14+CD16+ monocyte count for MACE in elderly patients with diabetic mellitus

2.5 相关性分析 Spearman秩相关分析结果显示，ΔTMAO与老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+单核细胞计数呈正相关（rs=0.200，P=0.047）；ΔD-乳酸与老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+单核细胞计数无直线相关关系（rs=0.119，P＞0.05）。ΔTMAO和ΔD-乳酸与MACE（+）组患者ΔCD14+CD16+单核细胞计数呈正相关（rs值分别为 0.322、0.290，P值分别为0.028、0.048）。

3 讨论

研究表明，约有1012种细菌定植在人类胃肠道，其中机会性病原体有109种［5］。本研究结果显示，MACE（+）组OTU总数、香农指数及血浆肠道菌群百分比均高于对照组和MACE（-）组；主坐标分析结果显示，MACE（+）组血液细菌特征与对照组或MACE（-）组明显分开，提示发生MACE的老年糖尿病患者全身微生物组与未发生MACE的老年糖尿病患者和对照者不同，其主要表现为全身微生物组多样性增加，而肠道菌群可能是导致全身微生物组多样性增加的主要原因。

TMAO和D-乳酸是肠道菌群的代谢产物，二者均被认为是肠道菌群易位和肠道黏膜通透性增加的标志物［6］。临床研究表明，TMAO与糖尿病患者发生心血管并发症有关［7］。在糖尿病患者中，TMAO是其发生心血管事件的重要标志物［8］。此外，TMAO水平升高的糖尿病患者心血管疾病风险和主要心脏事件发生率升高［9］。血浆TMAO水平升高与舒张功能障碍发生率和死亡率增加有关［10］。本研究结果显示，MACE（+）组TMAO、ΔTMAO高于MACE（-）组。D-乳酸是肠道屏障丧失和肠道黏膜通透性增加的标志物［11］。本研究结果显示，MACE（+）组D-乳酸和ΔD-乳酸高于MACE（-）组；多因素Cox比例风险回归分析结果显示，hs-CRP、CD14+CD16+单核细胞计数、Z评分是老年糖尿病患者发生MACE的独立影响因素，提示肠道菌群易位是老年糖尿病患者发生MACE的影响因素。

ROC曲线分析结果显示，ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z评分、Z评分+hs-CRP+CD14+CD16+单核细胞计数预测老年糖尿病患者发生MACE的AUC分别为0.647、0.630、0.681、0.822，提示与ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z评分单独预测相比，Z评分+hs-CRP+CD14+CD16+单核细胞计数预测老年糖尿病患者发生MACE的价值较高，肠道菌群易位进入全身循环可能是诱导老年糖尿病患者发生MACE的主要原因之一。

本研究结果显示，ΔTMAO与老年糖尿病患者ΔCD14+CD16+单核细胞计数呈正相关，ΔTMAO和ΔD-乳酸与MACE（+）组患者ΔCD14+CD16+单核细胞计数呈正相关。推测肠道菌群代谢产物在体循环中的积累会触发单核细胞的募集，从而激活全身炎症反应并最终导致心脏损伤［12］。研究表明，采用TMAO等肠道菌群代谢产物刺激单核细胞亚群可产生促炎细胞因子TNF-α，进而调节免疫反应［13］。这种肠道菌群的驱动作用也得到了既往研究的支持，即肠道菌群可以通过调节造血功能而直接影响先天免疫细胞的发育［14］。有证据表明，人骨髓含有CD14+CD16+单核细胞库［15］，表明MACE发生后血液循环中的CD14+CD16+单核细胞可能直接从骨髓或脾脏库中调动。

综上所述，发生MACE的老年糖尿病患者全身微生物组多样性增加，肠道菌群易位是老年糖尿病患者发生MACE的影响因素；且与ΔTMAO、ΔD-乳酸、Z评分单独预测相比，Z评分+hs-CRP+CD14+CD16+单核细胞计数预测老年糖尿病患者发生MACE的价值较高。但本研究样本量有限，可能影响结果的可信度。未来仍需通过前瞻性、大样本量研究进一步验证本研究结果。

作者贡献：陆水英进行文章的构思与设计，结果分析与解释，负责撰写、修订论文；刘琳进行研究的实施与可行性分析；陈力行进行数据收集、整理、分析；汤之明负责文章的质量控制及审校，并对文章整体负责、监督管理。

本文无利益冲突。