水稻多胚候选基因OsPE可变剪接体鉴定与分析

熊 翔,何 勇,刘焕焕,刘之恩,田志宏

(长江大学 生命科学学院,湿地生态与农业利用教育部工程研究中心,涝渍灾害与湿地农业湖北省重点实验室,湖北 荆州 434025)

多胚现象是在一个胚珠中形成多个胚的现象,常被认为是无融合生殖的象征[1]。目前,相关研究普遍认为无融合生殖应用于植物育种,可以有效固定优良基因组合并保持杂种优势[2-6]。鉴于1925年Rodrigo和1928年Jones报道的水稻一籽多苗,以及1927—1928年Terada发现水稻一个胚珠中有2个胚囊存在的现象,国内外研究人员多认为水稻多胚苗的出现可能是无融合生殖的结果。中国早期水稻无融合生殖研究也一直聚焦于水稻多胚苗的筛选和鉴定,力求能获得水稻无融合生殖的种质资源,并用于水稻育种[7]。2010年,Puri等[8]报道了籼稻品种巴斯马蒂370基因转化事件中产生的一个高频、可遗传的多胚突变体(OsPE),经分析发现:该突变体是一个功能获得性的突变体,多胚苗频率可达15%～20%,多胚种子在突变体穗中随机分布。继而,通过Tail-PCR克隆了OsPE的全长cDNA,并将其定为水稻多胚的候选基因。随后,Paul等[9]对OsPE突变体进行了详细的细胞学和组织学分析。但是,NCBI检索却显示OsPE为NST1应激反应蛋白。因此,OsPE基因是否能真正控制水稻多胚的产生,尚待进一步研究。

目前,众多研究表明,RNA选择性剪接在植物的成花诱导[10]、昼夜节律(生物钟)[11-12]和非生物胁迫响应[13-16]等生长发育及环境适应过程中起着重要的作用。生物信息学初步分析显示,OsPE基因在粳稻中存在3种可变剪接体,在籼稻中无可变剪接体。因此,通过分析水稻OsPE基因序列及其可变剪接体,有助于深入研究OsPE基因功能及其调控水稻多胚产生的分子机制——OsPE是否能真正控制水稻多胚的产生;或者,OsPE在水稻中存在可变剪接体,在其他剪接体的参与下,共同调控水稻多胚的产生;或者,OsPE另具功能。

本研究以粳稻品种日本晴和籼稻品种巴斯马蒂370为研究材料,根据生物信息学分析结果设计特异引物,通过RT-PCR及TA克隆技术对OsPE基因的可变剪接体进行鉴定,以确定其可变剪接体的真实存在,并进一步利用生物信息学工具对其编码蛋白进行进化分析及功能预测,为后续深入研究该基因在水稻中的生物学功能奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

粳稻品种日本晴(Oryzasativassp.Japonica cv.Nipponbare)和籼稻品巴斯马蒂370(Oryzasativassp.Indica cv.Basmati 370),田间正常栽培管理。pCloneEZ-Blunt TOPO(Clone Smarter)平末端克隆载体,DH10B大肠杆菌菌株均由长江大学生命科学学院水稻分子生物学课题组提供。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA提取及cDNA第一链合成 取正常栽培条件下生长的日本晴和巴斯马蒂370成熟叶片,采用TRIzol法提取RNA。按逆转录试剂盒(中稻)说明书合成日本晴和巴斯马蒂370成熟叶片cDNA第一链。

1.2.2OsPE可变剪接体分析及引物设计 Gramene(http://www.gramene.org/)数据库资料显示,OsPE基因在粳稻中存在3种可变剪接体,以a～c进行区分(表1);在籼稻中无可变剪接体存在。根据粳稻中OsPE基因可变剪接体序列特征,利用Primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)设计特异性引物(表2),由北京擎科新业生物技术有限公司武汉分公司合成。

表1 水稻OsPE基因可能存在的3种可变剪接体Tab.1 Three putative splice variants of rice OsPE gene

表2 OsPE基因可变剪接体扩增引物及扩增产物信息Tab.2 Information of primers and PCR product in splice variants of OsPE gene

1.2.3 RT-PCR扩增及目的片段纯化回收 以1.2.1中合成的cDNA为模板,利用Phanta®Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)高保真酶和表2所列引物对OsPE基因的可变剪接体进行RT-PCR扩增。PCR扩增完成后,取5 μL PCR产物用于1.0%的琼脂糖凝胶电泳(120 V,30 min)检测,通过凝胶成像系统对电泳结果进行拍照记录。剩余PCR产物经FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)回收后,用于后续pCloneEZ-Blunt TOPO平末端克隆。

1.2.4 平末端克隆 利用pCloneEZ-Blunt TOPO Cloning Kit(Clone Smarter)试剂盒,将纯化的目的片段与pCloneEZ-Blunt TOPO载体连接,连接产物转化大肠杆菌DH10B菌株,挑取单克隆进行PCR鉴定,阳性克隆送北京擎科新业生物技术有限公司武汉分公司测序。

1.2.5OsPE基因可变剪接体表达分析 以1.2.1中合成的cDNA为模板,表2中所列引物对CDSOsPEaF/OsPEabc-qRTR、OsPEbF/OsPEabc-qRTR和OsPEcF/OsPEabc-qRTR,利用Phanta®Super-Fidelity DNA Polymerase(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)高保真酶进行OsPE基因可变剪接体半定量分析,进一步利用qPCR验证半定量分析结果。

1.2.6 OsPE蛋白进化分析及功能预测 基于上述获得的OsPE的可变剪接体对应的蛋白序列,分别通过NCBI(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Gramene(http://www.gramene.org/)数据库检索OsPE可变剪接体编码蛋白同源序列,并对检索结果进行分类汇总和多序列比对分析。根据查询到的序列,采用MEGA 7.0对同源序列进行蛋白进化分析(MJ建模筛选出优化模型JTT+G,Bootstrap=1000),并用Evolview(https://www.evolgenius.info/evolview/#/)进行美化。

2 结果与分析

2.1 OsPE基因可变剪接体及RT-PCR特异引物位置

Gramene(http://www.gramene.org/)数据库资料显示,OsPE基因在粳稻中存在3种可变剪接体,a～c可变剪接体分别代表了LOC_Os03g13810.1、LOC_Os03g13810.2和LOC_Os03g13810.3。其中a剪接体的mRNA比b剪接体多了8 bp(即AA和CTCCAG);c剪接体的mRNA完整保留了a剪接体的第一内含子序列,其CDS序列与a和b剪接体3′端序列完全相同。在籼稻中无可变剪接体存在。根据这些可变剪接体序列及结构特征,设计了RT-PCR扩增的特异引物,位置如图1所示。

图1 OsPE基因可能存在的3种可变剪接体及引物位置Fig.1 Three putative splice variants of OsPE gene and their specific primer locations

2.2 OsPE基因可变剪接体的RT-PCR扩增及克隆

通过RT-PCR引物OsPEabF/OsPEabcR和OsPEcF/OsPEabcR从日本晴和巴斯马蒂370成熟叶片cDNA中均扩增得到预期条带(图2-A),泳道1条带大小与1 344 bp大小基本一致,初步说明可能包含a和(或)b剪接体;泳道2条带大小与预期的1 304 bp大小基本一致,初步说明c剪接体的存在。取泳道1产物为模板,利用CDSOsPEaF/OsPEabcR和CDSOsPEbF/OsPEabcR引物对进行RT-PCR扩增,也获得了预期的PCR产物(图2-B),泳道1为CDSOsPEaF/OsPEabcR引物对的扩增产物,大小与1 251 bp基本一致,初步表明a剪接体的存在,泳道2为CDSOsPEbF/OsPEabcR引物对的扩增产物,大小与1 245 bp基本一致,初步表明b剪接体的存在。

A:M.DL2000 DNA Marker,1.引物OsPEabF/OsPEabcR扩增产物,2.引物OsPEbF/OsPEabcR扩增产物;B:M.DL2000 DNA Marker,1.引物CDSOsPEaF/OsPEabcR扩增产物,2.引物CDSOsPEbF/OsPEabcR扩增产物。A:M.DL2000 DNA Marker,1.Amplification product of primers OsPEabF/OsPEabcR, 2.Amplication product of primers OsPEcF/OsPEabcR;B:M.DL2000 DNA Marker, 1.Amplification product of primers CDSOsPEaF/OsPEabcR, 2.Amplification product of primers CDSOsPEcF/OsPEabcR.

为进一步确认OsPE基因可变剪接体的真实存在,将上述CDSOsPEaF/OsPEabcR、CDSOsPEbF/OsPEabcR和OsPEcF/OsPEabcR引物对的RT-PCR扩增产物纯化回收,TA克隆后挑取阳性克隆测序验证。序列比对结果显示,从日本晴和巴斯马蒂370成熟叶片cDNA中扩增得到的片段与OsPE各剪接异构体序列完全一致(图3-A—C),这表明,OsPE的3种可变剪接体在粳稻中是真实存在的,OsPEc剪接体在籼稻中也真实存在,OsPEa和OsPEb是在籼稻中鉴定到的2种新剪接体。综上所述,在水稻中成功鉴定到OsPE的3种可变剪接体。

图3 OsPE基因可变剪接体序列比对结果Fig.3 Sequence alignment results of OsPE gene splice variants

2.3 OsPE基因可变剪接体表达趋势分析

为了研究OsPE的生物学功能,选择日本晴和巴斯马蒂370成熟叶片,通过半定量分析和qPCR对OsPE不同可变剪接体进行了表达趋势分析。结果表明,OsPE各剪接体在正常生长条件下的日本晴和巴斯马蒂370成熟叶片中存在表达差异,依次为OsPEc>OsPEa>OsPEb,但表达趋势相同(图4)。这一结果表明,OsPEc剪接体在OsPE基因功能发挥中可能占主导。

1,2,3.OsPEa、OsPEb和OsPEc可变剪接体。数据以3次生物学重复平均值±标准差表示,不同小写字母表示OsPE各可变剪接体在0.05水平上有显著差异(n=3,邓肯检验)。1,2,3 .OsPEa,OsPEb, and OsPEc variable splices,respectively.The data were expressed as the mean±standard deviation of three biological replicates. Different lowercase letters indicated that there was a significant difference at 0.05 level among the variable splices of OsPE(n=3, Duncan test).

2.4 OsPE同源蛋白进化分析及功能预测

分别通过NCBI和Gramene数据库对鉴定到的OsPE基因可变剪接体进行植物同源蛋白检索。检索结果涉及了双子叶植物野生烟草(Nicotianaattenuata)和拟南芥(Arabidopsisthaliana),单子叶植物大麦(Hordeumvulgare)、短药野生稻(Oryzabrachyantha)、籼稻(OryzasativaIndicaGroup)、粳稻(OryzasativaJaponicaGroup)、疣粒稻(Oryza meyerianavar.granulata)、黍(Panicum hallii)、柳枝稷(Panicum virgatum)、粟(Setaria italica)、狗尾草(Setaria viridis)、高粱(Sorghum bicolor)、普通小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)和沼生菰(Zizania palustris)共15个物种的44个同源蛋白。同源蛋白进化树显示,OsPE在双子叶植物和单子叶植物中存在不同的进化路线,亲缘关系较远(图5-A)。在单子叶植物中,OsPE仅在禾本科植物中存在同源蛋白,稻属植物表现出与其他属植物不同的进化路线,在稻属植物中高度保守(除短花药野生稻外),蛋白序列一致性均高达99%以上(图5-A)。同源蛋白比对汇总结果显示,OsPE无典型保守结构域,检索到的同源蛋白大部分无功能注释,有功能注释的同源蛋白主要行使抗逆响应、细胞分裂和细胞凋亡等功能(图5-B)。综合同源蛋白比对和进化树分析结果来看,OsPE在禾本科,尤其是稻属植物中高度保守,是稻属植物所特有的一个功能基因,有待于进一步研究该基因是否参与调控水稻抗逆响应、细胞分裂及细胞凋亡等生物学功能,而不是调控水稻多胚产生。

A.不同物种OsPE基因同源蛋白进化树;B.不同物种OsPE基因同源蛋白功能预测。A.Evolution tree of OsPE gene homologous proteins in different species; B.Functional prediction of OsPE gene homologous proteins in different species.

3 结论与讨论

虽然Puri等[8]通过籼稻品种巴斯马蒂370基因转化事件中产生的多胚突变体(OsPE)研究将OsPE定为水稻多胚的候选基因,Paul等[9]也对OsPE突变体进行了详细的细胞学和组织学分析,但OsPE基因的后续功能验证未见报道,而且生物信息学初步分析显示:OsPE基因在粳稻中存在3种可变剪接体,在籼稻中无可变剪接体,NCBI检索显示其为NST1应激反应蛋白。本研究选取来源于15个物种的44个同源蛋白,基于蛋白氨基酸序列构建系统发育进化树,对水稻OsPE基因编码蛋白进行了进化分析及功能预测,发现OsPE蛋白在禾本科,尤其是稻属中高度保守(蛋白序列一致性普遍高于99%),有功能注释的同源蛋白与调控抗逆响应、细胞分裂及细胞凋亡等生物学功能相关,而不调控多胚产生。因此,OsPE基因是否能真正控制水稻多胚的产生,尚待商榷,有待进一步研究证明。

目前,众多研究表明,植物和动物甚至人,尽管在形态和生理上有显著差异,选择性剪接作为以多种方式调节基因表达的一种基因调控机制,普遍存在于包括植物和人在内的所有多细胞真核生物中[17-20]。选择性剪接在植物的光形态建成[21]、成花诱导[10]、昼夜节律(生物钟)[11-12]和非生物胁迫响应[13-16]等生长发育及环境适应过程中起着重要的作用。本研究利用RT-PCR扩增,结合TA克隆及测序验证,在粳稻品种日本晴中鉴定到了OsPE基因3种可变剪接体的真实存在,在籼稻品种巴斯马蒂370中鉴定到2种新的可变剪接体。在对正常生长条件下的供试材料成熟叶片进行半定量及qPCR分析时,发现OsPE基因可变剪接体存在表达差异,依次为OsPEc>OsPEa>OsPEb,且该基因在不同水稻品种中存在相同的表达趋势。所以,是否由于OsPE在水稻中存在可变剪接体,在其他剪接体的参与下,共同调控水稻多胚的产生,有待进一步研究,以挖掘其可能调控水稻多胚产生的分子机制。

综上所述,水稻多胚候选基因OsPE可变剪接体的鉴定结果将为进一步研究水稻OsPE基因的真实生物学功能或其可能调控水稻多胚产生的分子机制奠定基础,为后续的试验研究提供必要的理论依据。