犬、猫犬小孢子菌感染研究进展

郭 沛,矫晓倩,单 虎,刘家国,秦志华*

(1.南京农业大学 动物医学院,江苏 南京210095;2.青岛农业大学 动物医学院,山东 青岛 266109)

犬小孢子菌(Microsporumcanis)是一种常见的致病性皮肤癣菌[1],根据生存环境,皮肤癣菌分为亲人性、亲土性和亲动物性[2]。犬小孢子菌属于皮肤癣菌小孢子菌属,其在SDA培养基上呈淡黄色和白色绒毛状,2周后产生大量菌丝呈羊毛状,中央趋向于粉末化。犬小孢子菌菌丝有隔,可产生纺锤形大分生孢子及少许棒状小分生孢子,其中大分生孢子是其最明显的特征之一。犬小孢子菌在人与人之间的感染常有报道,而约有50%受感染的人是经由无症状的动物传染的[3],犬、猫犬小孢子菌感染也带来了人畜共患病的危险[4],因此犬、猫犬小孢子菌的防治对于公共卫生也具有举足轻重的意义。宠物犬、猫犬小孢子菌属于亲动物性真菌,大多存在于自然界及犬、猫等动物毛皮上,主要通过动物与动物或动物与人接触等途径直接传染,也可通过带菌的物品间接传染。犬小孢子菌可以在犬、猫等动物体上长时间存在而不致病[5-6],但当犬、猫抵抗力下降时,则会发生真菌性皮肤病。病发时,患病部位会呈现出不规则的鳞屑状隆起,同时会出现掉毛、断毛、丘疹、瘙痒、脓包等症状。犬、猫一经感染犬小孢子菌,不仅病程较长,而且较难根治,愈后易复发[7],对宠物健康造成很大危害。基于目前国内外犬小孢子菌的研究现状,现对犬小孢子菌感染犬、猫的流行情况、发病机制、诊断技术和治疗手段进行系统综述,以期为宠物犬小孢子菌的科学研究提供理论基础,为今后犬小孢子菌的诊断和治疗提供新思路。

1 流行情况

在宠物临床上,犬、猫皮肤真菌病是一种很常见且多发的疾病。皮肤真菌主要入侵皮肤、毛发或趾甲等部位,大量增殖而引起皮肤病变,而犬小孢子菌是引起皮肤真菌病的主要病原菌[1-2,5-6]。在世界其他地区,例如伊朗[8]、意大利[2]、尼日利亚[9]、巴西[10]、英国[11]等的研究均证实了犬小孢子菌在引发犬、猫皮肤真菌病中的重要地位。犬小孢子菌引发的犬、猫皮肤真菌病不仅严重影响宠物自身的生长发育,也可能威胁人类健康。

研究表明,季节、年龄、品种、营养状况以及自身抵抗力等因素很大程度上影响犬小孢子菌的发病和流行[12]。赵彬等[13]对2017年6月―2019年6月句容地区某动物医院收集的皮肤真菌病有效病例388例进行临床调查分析,发现犬小孢子菌为247株,占63.66%,经调查犬小孢子菌感染在3―9月份多发。张永东等[14]调查北京8家动物医院245例皮肤真菌病,发现犬小孢子菌是导致犬皮肤病的主要病原真菌,且幼龄犬、母犬、6―11月份、病犬头部和四肢发病率最高。翟晓虎等[15]对温州地区某动物医院2015年4月-2016年3月期间就诊的120例疑似皮肤真菌病患犬,采集患处被毛进行鉴别培养,发现犬小孢子菌检出率最高。安锡忠等[16]调查了2013年1―12月份期间,河北农业大学兽医院共接诊保定市皮肤病患犬266例,其中以感染犬小孢子菌为主,占真菌性皮肤病总数的53.23%,犬小孢子菌感染最多的品种是京巴犬和金毛猎犬,主要感染部位为四肢,雌雄患犬比率为1.2∶1.0,犬小孢子菌主要发生在0～2岁(含2岁)。

KATIRAEE等[8]对2015年3月-2018年3月就诊的308只患皮肤病的犬猫进行检测,发现真菌病103例,其中犬小孢子菌的检出率最高为78.5%,1岁以下的猫和犬的感染率(61.5%)显著高于1岁以上的犬、猫(P<0.05)。LONG等[11]整理了1991-2017年间向英国皇家兽医学院诊断实验室提交的犬、猫皮肤癣菌培养记录,使用常规方法鉴定皮肤真菌,结果发现犬小孢子菌在犬、猫上的分离率为91.9%,且在2岁以下的犬、猫中分离数量最多,品种以杰克罗素犬、杰克夏犬、波斯猫更常见。DETAR等[17]回顾了2年内在美国西北部动物收容所内被诊断为犬小孢子菌感染的猫病例,幼猫患病的几率是成猫的8倍,且夏季和秋季有更多猫患病。

国内外研究均证实了犬、猫皮肤真菌病的高发因素是犬小孢子菌,犬小孢子菌流行情况表现在春末至夏、秋初季多发,这一时期高温闷热、阴雨潮湿适宜真菌孳生,也成为犬小孢子菌感染高峰;幼龄犬、猫患病率明显高于成年犬、猫,究其原因是犬、猫皮肤皮脂腺分泌不饱和脂肪酸可抑制犬小孢子菌在皮肤及其附属结构的生长与繁殖,幼龄犬、猫皮肤分泌较少且免疫力较弱,对皮肤真菌病更加易感;多发品种主要与当地主要饲养品种及频繁洗澡有关,例如国内有些地区京巴犬和金毛猎犬多发,国外某地区杰克夏犬、波斯猫多发。

2 发病机制

感染初始,犬小孢子菌附着在犬、猫毛发、趾甲等组织的角蛋白上[18-19],真菌的毒力、宿主的免疫状态在该病的进展中起着重要作用。犬、猫感染途径是通过皮肤伤口、疤痕或烧伤[20],这种感染通过直接接触患病犬、猫,或者间接通过患病犬、猫接触的毛毯、床罩、玩具、笼子、衣服和其他被孢子污染的物品发生[20-21]。犬小孢子菌的潜伏期为1～4周[21],在感染后6 h分生孢子与角蛋白附着最多[20],犬小孢子菌定殖导致宿主内的各种免疫反应,包括炎症[22],在感染皮肤区域看到明显的炎症反应,如发红、肿胀和掉毛[23-24]。犬小孢子菌产生角蛋白水解酶,角蛋白在犬小孢子菌定殖后成为唯一的营养来源,促进角质层中的真菌生长,并导致表皮角质化[19-20,24]。通过释放丝氨酸蛋白酶而产生蛋白分解活性,从而导致宿主的外部蛋白受损,造成皮肤损伤[20,24]。犬小孢子菌感染途径如图1所示[24]。

图1 犬小孢子菌进入宿主的示意图

目前,犬小孢子菌发病机制的研究普遍认为与蛋白酶的分泌和宿主的免疫反应有关[26-27]。研究发现,犬小孢子菌感染有关的蛋白酶包括角蛋白酶、弹性蛋白酶、胶原酶、酯酶、神经酰胺酶、磷酸酶等[28],其中角蛋白酶的致病性比较明确。VIANI等[29]通过比较有症状和无症状犬、猫产生的蛋白酶的区别,结果发现有症状组的角蛋白酶和弹性蛋白酶的活性高于无症状组,角蛋白酶和弹性蛋白酶活性高的菌株感染动物模型的临床症状重。皮肤的物理屏障在感染的第一阶段免疫反应中发挥重要作用[30-31],通过表皮细胞增殖和消除角质层上的真菌渗透发挥作用。当犬、猫免疫能力较强时犬小孢子菌在皮肤屏障、炎症过程及细胞免疫中就被清除。研究报道,皮肤真菌细胞壁成分可被宿主细胞模式识别受体(PRRs)识别,例如Toll样受体(toll-like receptor,TLRs)[32],TLR2信号诱导炎性细胞因子如TNF、IL-1β和IL-10[33-34]的产生。在炎症过程中,PRRs激活中性粒细胞和巨噬细胞,通过扰乱真菌细胞的渗透平衡而起到保护作用。SHA等[35]发现,真菌感染初期引起的体液免疫反应能够诱导IL-17的产生,IL-17是一种促炎细胞因子,介导真菌感染的炎症反应中心。据报道,IL-17在犬小孢子菌感染中抑制真菌生长和促进炎症反应,IL-17缺陷的病人更易感染皮肤真菌[36-37]。

3 诊断技术

犬小孢子菌临床诊断通过临床症状、伍德氏灯检查和实验室镜检进行初步诊断,以SDA等进行接种纯培养和镜检分离鉴定致病真菌病原。临床上犬、猫感染犬小孢子菌导致面部、腿部、尾部局部皮肤损害[38],如多灶性掉毛、红斑、瘙痒、丘疹、脓疱疹、鳞屑和结痂,犬小孢子菌感染会导致犬、猫感染区域皮肤掉毛(1～3 mm),在长期感染后引发炎症反应发生永久性掉毛[39]。

伍德氏灯检查法是宠物临床上的一种快速有效地诊断真菌性皮肤病的方法[40],通过在暗室内直接照射患犬病变区的毛发、皮屑或皮损区(也可取患犬被毛或皮肤刮取物在暗室里用伍德氏灯照射),观察荧光反应,如果出现黄绿色荧光,则可判为真菌感染。这种方法操作简单,同时能够快速准确地得出诊断结果,确定病原,而且检查时不会引起犬、猫应激反应,也不会造成二次损伤,是目前国内宠物临床上广泛使用的一种真菌感染的诊断方法,但是该方法不能确诊是否为犬小孢子菌感染,还需要配合其他实验室诊断。

实验室诊断方法是对临床样本进行显微镜检来检查菌落的大体形态特征(例如生长速度、菌落形态、色素)、显微形态(例如大孢子、小孢子和菌丝的形状和大小)、生理指标等[41]。图2展示了显微镜下犬小孢子菌的菌落形态。

A.菌落呈棉状,白色到浅黄色;随培养时间延长呈棕黄色;B.显微镜下的犬小孢子菌乳酸酚棉蓝染色图(a.大分生孢子;b.小分生孢子;c.菌丝;d.衣原体分生孢子[42])

分子生物学的最新进展和技术的进步使微生物学中物种确定和菌株分型的新技术得以发展,开发了可靠的皮肤真菌鉴定方法。聚合酶链式反应(PCR)、限制性片段长度多态性(RFLP)和/或直接测序技术、基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)等技术已被用于鉴定和区分真菌的物种或基因类型。犬小孢子菌的PCR检测方法一直是研究中的热点,以18S rDNA、ITS区等序列来设计引物,扩增片段长度从176～620 bp不等,都可以在几小时内快速准确地鉴定是否为犬小孢子菌感染[43-44]。有学者利用PCR-RFLP技术对伊朗地区临床标本中重要皮肤真菌的种间和种内基因组变异进行鉴定,证明该方法快速、灵敏,是一种有益的鉴定工具,通过琼脂糖凝胶电泳上产生特征条带,可在5 h内成功鉴定真菌种类[41]。MALDI-TOF MS对于发现疾病生物标志物和研究药物代谢等方面具有重要意义,并具有良好的临床应用前景,近期一些研究发现MALDI-TOFMS也可以作为鉴定临床病原体的技术,用于真菌鉴定,检测速度快、准确度高[45-46]。

4 治疗策略

由于犬小孢子菌感染的高度传染性,一经发现必须配合良好的治疗,以防止传染其他犬、猫或宠物主人[47]。犬小孢子菌病的传统治疗方法主要分为内服和外用,外用药一般有克霉唑软膏、咪康唑软膏等,而内服药一般有灰黄霉素、酮康唑、特比萘芬、伊曲康唑、氟康唑等[47-49]。ABASTABAR等[50]从伊朗、法国和土耳其的皮肤真菌病患者和动物身上获得的大量犬小孢子菌临床分离株(n=208),比较了15种抗真菌药物的抑菌效果,结果如表1所示,所有药物都表现出良好的抗真菌活性,其中,氟康唑的MIC范围最宽(0.064～128.000 mg/L),其次是酮康唑和克霉唑(0.016～32.000 mg/L)[48]。WANG等[51]研究了酮康唑(KTZ)等咪唑类药物在治疗犬小孢子菌感染中的作用,RNA聚合酶、类固醇生物合成和核糖体生物发生3条通路与KTZ的作用机制密切相关,结果表明,KTZ可能通过3个途径中的CYP51、SQL、ERG6、ATM、ABCB1、SC、KER33、RPA1和RNP基因改变细胞膜通透性,破坏细胞壁,抑制有丝分裂和转录调控。特比萘芬作为临床上常用的抗真菌药物对犬小孢子菌的作用机制已有报道[52]。通过实时定量PCR研究特比萘芬对4种耐药基因(PDR1、MDR1、MDR2、MDR4)表达的影响,结果发现与对照组相比,有特比萘芬存在的培养组4种基因表达水平升高2～4倍,同时显示特比萘芬对犬小孢子菌的抗菌活性与编码ABC转运蛋白的基因过表达有关。临床数据表明,部分抗真菌药物在治疗人类和动物真菌感染时无效果[1],这很可能是出现了对药物具有耐药性的菌株,当临床病例持续感染或在适当剂量的抗真菌药物治疗后4周内复发时,通常怀疑为临床耐药[48],这是因为抗真菌药物的皮肤药代动力学(PK)结果显示药物在停药后3～4周才会渗透到角质层[53]。针对临床犬小孢子菌耐药性出现,研究人员也研究了其他具有抗真菌活性的物质,例如抗菌肽、植物提取物、植物精油等。TUNSAGOOL等[54]研究了从枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中提取的环状脂肽(CLPs)对从猫皮肤上分离的犬小孢子菌的抑制作用,所有纯化的芽孢杆菌提取物均具有抑制犬小孢子菌生长的活性,药物共培养72 h后,CLPs对犬小孢子菌的抑制率为62.21%。李志等[55]为了评价中草药复方治疗犬小孢子菌的效果,组方白藓皮、苦参、蛇床子等药材煎汤热敷患部,结果发现药浴可明显消减犬皮肤真菌病的临床病理变化,对犬皮肤致病真菌具有较高的清除率,说明中药组方对犬皮肤真菌病治愈率高、疗效快、疗效确实。经试验证明具有明显抗真菌活性的植物精油有山苍子、八角茴香、小茴香、天竺葵精油混合物,百里香、牛至、迷迭香、八角茴香和柠檬柑橘精油混合物等[56-57]。

表1 15种抗真菌药物对208株犬小孢子菌的抑菌效果

5 小结

犬小孢子菌作为亲动物性真菌,在宠物犬、猫身上可以长期存在而不致病,随着宠物事业的发展,人类与宠物犬、猫的关系日益密切,导致犬小孢子菌在宠物与人之间传播,对人们的身体健康造成严重威胁。宠物临床上犬小孢子菌多在高温闷热、阴雨潮湿的季节多发,幼龄犬、猫多发,在宠物饲养过程中应注意提高犬、猫免疫力,适度保持皮毛干净,减少犬小孢子菌感染的可能性。随着分子生物学发展,犬小孢子菌的诊断也从传统的菌株培养鉴定,逐渐发展到利用PCR、ITS、MS等方法弥补传统方法中主观经验的不足,但是由于这些方法复杂、仪器要求高、检测费用增加等原因,在宠物临床上没有广泛应用,因此,需要开发一种便携式、价格低、操作简便的诊断方法辅助临床快速诊断。

宠物临床上犬小孢子菌高度传染,一经发现必须配合良好的治疗,以防止传染其他犬、猫或宠物主人,传统治疗方法是使用各种化学药物,例如酮康唑、特比萘芬等,用药过程中需特别注意规范用药,防止出现犬小孢子菌耐药的情况。因此,需要更多的研究以深入探究犬、猫犬小孢子菌耐药机制,以减少临床上耐药菌株的出现;同时开发新的宠物专用治疗犬、猫犬小孢子菌的化学药物或天然药物。