基于SCoT分子标记的37份葡萄种质遗传多样性分析

马玉姣，何西堂，吴玉森，刘利，李勃，李秀杰*

（1. 山东省葡萄研究院，山东济南 250100；2. 莒南县城乡建设综合服务中心，山东莒南 276699）

近年来，DNA分子标记因其操作简单、反应灵敏、应用范围广及受环境因素干扰小等显著优点，广泛应用于葡萄遗传多样性分析[1-3]。其中，目标起始密码子多态性（Start codon targeted polymorphism，SCoT）分子标记由Collard和Mackill[4]在水稻研究中开发，是基于ATG起始密码子两侧短序列的保守性，利用单引物对基因组进行PCR扩增的分子标记方法。相比于SSR、ISSR、AFLP等传统分子标记，SCoT具有成本低、操作简单、重复性好、引物通用性强等优势，已广泛应用于龙眼、芒果、柿、猕猴桃、桃、樱桃等[5-10]多种果树的多态性和系统发育关系的分析研究。

葡萄为葡萄科（Vitaceae）葡萄属（VitisL.）植物，是最古老的植物之一[11]。我国现有资源圃中保存的葡萄种质达3000多份[12]，品种丰富多样，种植范围广，在落叶果树生产中占据重要的位置[13]。近年来，随着国内葡萄新品种的不断选育，其中不乏自然变异及民间选育的品种，加之地区之间品种交流频繁，导致出现“同名异物”或“同物异名”现象[14]。因此，开展葡萄种质资源研究，仅靠形态学标记已远远不够，必须借助简单高效的分子标记，以实现对种质遗传关系及多样性的精准鉴定。目前，SCoT分子标记虽已在葡萄上有所应用[15-16]，但缺乏对主栽品种和自主选育品种的遗传关系及多样性分析。本研究基于SCoT分子标记技术，利用11对多态性好的引物，对中国农业科学院郑州果树研究所国家葡萄种质资源圃（郑州）和山东省果树研究所金牛山基地（泰安）的主栽品种和自主选育品种（优系）共37份种质进行遗传关系及遗传多样性分析，筛选部分品种的潜在亲本，为葡萄遗传育种工作中亲本的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究所选取的37份样品材料，包括27个现有栽培品种：红地球、美人指、红巴拉多、魏可、秋红、秋黑、安艺皇后、巨玫瑰、乍娜、红乳、矢富罗莎、玫瑰香、巨星、里扎马特、红鸡心、着色香、牛奶、京秀、黑巴拉多、蜜汁、凤凰51、巨峰、红双味、弗雷无核、早霞玫瑰、山东早红、87-1，来自国家葡萄种质资源圃（郑州）；MPG1、JM19、JFF19、JFH19、JF19、锦红[17]、藤稔芽变7个自育品种（系）及巨峰、藤稔、摩尔多瓦3个现有栽培品种取自金牛山基地（泰安），巨峰在两地同时采样（表1）。上述种质于2020年8月取样，每份样品随机采集幼嫩叶片10片，迅速置于液氮中带回实验室，保存至-80 ℃冰箱中备用。

表1 试验所需葡萄种质详细信息Table 1 Detail information of the tested grape accessions

1.2 葡萄DNA的提取

采用CTAB法提取葡萄叶片基因组DNA，通过1%凝胶电泳和微量核酸蛋白浓度测定仪（NanoDrop2000，Thermo，USA）检测其纯度和浓度，并用ddH2O统一稀释至30 ng·μL-1，保存至-20 ℃冰箱备用。

1.3 SCoT引物及PCR扩增

本试验所用引物（表2）均已报道[3-4]，SCoT-PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。SCoT-PCR反应体系（20 μL）：2×PCR Mix 10 μL，SCoT引物（10 μmol）1 μL，30 ng·μL-1DNA 1 μL，ddH2O 8 μL。扩增程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，进行35个循环；72 ℃延伸10 min。将扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用ChamlGel 6000型凝胶成像系统进行观察并拍照。

表2 11条SCoT引物序列及多态性信息Table 2 Polymorphism of 11 SCoT primers in samples

1.4 数据统计与分析

根据扩增结果对条带进行统计，记录迁徙位置。对同一迁徙位置的电泳条带进行赋值，“0”表示无条带，“1”表示有条带，构建原始（0,1）矩阵。使用软件NTSYSpc 2.10对（0,1）矩阵中不同种质进行遗传相似系数分析，根据软件中构建的（0,1）矩阵对37份葡萄种质进行主坐标分析，同时利用UPGMA法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄种质SCoT-PCR扩增产物多态性分析

利用11条SCoT引物分别对37份葡萄种质进行SCoT-PCR扩增，共得到整齐、清晰的条带115条，平均每条引物扩增得到10.45条；其中扩增条带最多的是SCoT40，共15条；最少的是SCoT23和SCoT37，仅8条；扩增共得到多态性条带102条，平均多态性比率为87.9%。多态性比率最高的SCoT6和SCoT37，均为100%；最少的是SCoT23，为62.5%（表2）。结果表明，本研究使用的11条SCoT引物扩增条带多态性丰富，且试验中用到的葡萄种质遗传多样性丰富。

2.2 基于SCoT标记的葡萄种质遗传聚类分析

基于对37份葡萄种质样品建立的（0,1）矩阵，对其遗传相似系数进行分析，结果显示遗传相似性系数范围在0.612～0.929，平均值为0.776（图1）。37份种质中有20对遗传相似系数大于0.850。其中，巨玫瑰（8）和玫瑰香（12）、巨星（13）和里扎马特（14）、早霞玫瑰（25）和山东早红（26）、JF19（29）和JFH19（32）、JFF19（31）和JFH19（32）、藤稔（35）和藤稔芽变（36）含有亲本关系或使用了同一亲本，而藤稔（35）和藤稔芽变（36）相似系数高达0.929，说明芽变品种‘藤稔芽变’与其母本‘藤稔’之间相似性极高。37份种质中遗传相似系数最小的为凤凰51（21）和JF19（29），仅为0.612，说明二者具有不同的遗传背景。

图1 37份葡萄种质遗传相似性系数热图Figure 1 Heat map of genetic similarity coefficient among 37 grape germplasms

2.3 葡萄种质聚类分析和主坐标分析

对37份种质进行聚类分析结果显示，当遗传距离为0.67时，可将37份葡萄种质分为两类，第Ⅰ类包含30份种质（图2），第Ⅱ类包含7个种质，进一步分类可将其分为6组。第1组包括红地球、美人指、乍娜、秋黑、87-1、藤稔、藤稔芽变和红巴拉多8个种质；第2组包括巨玫瑰、玫瑰香、红鸡心、矢富罗莎、红乳、巨星、里扎马特、牛奶、黑巴拉多和锦红10份种质；第3组包括魏可、早霞玫瑰、山东早红、秋红、JFH19、JFF19和着色香7份种质；第4组包括安艺皇后、红双味、凤凰51、京秀和弗雷无核5个种质；第5组包括蜜汁、巨峰（郑州）、JF19和巨峰（泰安）4个种质；第6组包括MPG1、JM19和摩尔多瓦3个种质。

图2 37份葡萄种质聚类分析图Figure 2 Cluster diagram of 37 grape germplasms

同时，利用遗传相似系数绘制了37份葡萄种质进行主坐标分析，并绘制散点图。如图3所示，可将37份葡萄种质分为4组：A组包括红地球（1）、美人指（2）、红巴拉多（3）、魏可（4）、秋红（5）、秋黑（6）、巨玫瑰（8）、乍娜（9）、红乳（10）、矢富罗莎（11）、玫瑰香（12）、巨星（13）、里扎马特（14）、红鸡心（15）、着色香（16）、牛奶（17）、京秀（18）、黑巴拉多（19）、弗雷无核（24）、早霞玫瑰（25）、山东早红（26）、87-1（27）、锦红（34）、藤稔（35）和藤稔芽变（36）25个种质；B组包括安艺皇后（7）、凤凰51（21）、红双味（23）、JFF19（31）和JFH19（32）5个种质；C组包括MPG1（30）、JM19（33）和摩尔多瓦（37）3个种质；D组包括蜜汁（20）、巨峰-郑州（22）、JF19（29）和巨峰-泰安（28）4个种质。主坐标分析中的A、B组和C、D组分别对应聚类分析图中的Ⅰ类和Ⅱ类，且每组成员与聚类分析结果基本吻合。相比于聚类分析图，主坐标分析图能更直观的表现出37个葡萄种质的亲缘关系。

图3 37份葡萄种质主坐标分析图Figure 3 Pricipal coordinate analysis of 37 grape germplasms

3 讨论与结论

葡萄为高度杂合的物种，种内变异大是葡萄具有遗传多样性的基础。利用分子标记对葡萄多样性及遗传关系进行鉴定，对葡萄育种和品种保护提供了重要参考[18-19]。近年来，利用SCoT标记进行葡萄种群间遗传多样性和亲缘关系的研究也有报道。王发明等[15]分别利用ISSR和SCoT对葡萄种质遗传多样性进行了分析，结果表明，相比于ISSR标记，SCoT分析的样本遗传多样性更高，且能更好的区分栽培种质和野生种质，在葡萄种质系统进化及遗传多样性评价中SCoT比ISSR更有优势，这与Kumer等[20]的研究结果相符。岳庆春等[16]利用SCoT分子标记对醉金香及其突变株进行遗传多样性分析发现，SCoT分子标记可以将亲缘关系近的样本聚到一起，说明SCoT分子标记可应用于葡萄种质遗传多样性的评价和杂交育种的早期鉴定工作中。

本研究选用山东地区鲜食葡萄主栽品种和自主选育的品种（优系），利用11对SCoT引物分析亲本关系和遗传多样性，平均多态性比例达到87.90%，高于可揭示多数葡萄种质的遗传差异；遗传范围区间为0.612～0.929，其中遗传相似系数大于0.850的有20对，遗传范围较窄；当遗传相似系数为0.67时，可将37份葡萄种质分为两大类。聚类分析结果表明，具有亲本关系的品种遗传距离很近，如：秋黑是美人指的后代，巨玫瑰是玫瑰香的后代，自主选育品种锦红是里扎马特的后代，芽变品种藤稔芽变是藤稔的后代，其中藤稔芽变和藤稔遗传相似系数高达0.929；多数使用了同一亲本的姊妹品种也聚类在同一支上，如：红鸡心和玫瑰香都是白玫瑰的后代，选育的优系JFF19和JFH19都是巨玫瑰的后代等，上述结果与利用SLAF-seq方法报道结果相符[2]。此外，由于葡萄种质遗传背景较为复杂，许多民间选育品种无法提供确切的亲本信息，如本文中提到的牛奶（亲本不详）和黑巴拉多遗传相似系数为0.844，87-1（亲本未知）和秋黑遗传相似系数为0.875，猜测二者可能具有直接亲本关系或为姊妹品种，SCoT标记对这类种质的亲本预测工作提供依据。

本研究利用SCoT分子标记客观评价了37份葡萄种质的遗传多样性，为拓宽葡萄种质的遗传基础提供了理论依据。同时，该方法可鉴定葡萄潜在的亲缘关系，为鉴定未知亲缘关系的品种提供参考依据。