他克莫司激活JAKs/STATs信号通路对川崎病小鼠血管内皮功能及心肌细胞凋亡的影响

娄 萍,赵 欣,赵 颖,张 丹

川崎病是一种皮肤黏膜淋巴结综合征,并发症表现为冠状动脉和心肌损伤,主要病理改变为全身非特异性血管炎,肌原纤维断裂及溶解,心肌细胞水肿、变性和坏死及炎性浸润等[1]。相关研究显示,川崎病可能与炎症及免疫调节失衡有关,由于免疫细胞的过度激活,使产生多种细胞因子介导的促炎与抗炎反应调节失衡,增强心脏冠状动脉损伤[2]。关于川崎病的临床研究越来越多,但川崎病诱发心肌损伤的机制尚未明确。他克莫司是一种新型免疫抑制剂,通过与细胞质内免疫亲和蛋白(macrophilin)结合抑制钙磷酸酶的活性,并调控T细胞活化,抑制肥大细胞释放细胞因子,可治疗炎症性皮肤疾病,目前他克莫司在临床中广泛用于器官移植和自身免疫系统疾病的治疗[3]。酪氨酸激酶(JAKs)/信号转导因子和转录激活因子(STATs)信号通路是细胞因子信号转导的重要途径,广泛分布于多种组织细胞,发挥特异的生物学作用,在参与机体免疫及肿瘤发展等过程中发挥着关键的作用[4]。有研究表明,JAKs/STATs信号通路与心脏等疾病的发生发展关系密切,介导了心肌细胞生长、存活,改善心血管疾病[5]。关于他克莫司治疗川崎病的研究报道较少。本研究观察他克莫司通过激活JAKs/STATs信号通路对川崎病小鼠血管内皮功能及心肌细胞凋亡的影响,可为临床治疗川崎病提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取健康级小鼠40只,雌雄各半,4～6个月龄,体质量150～240 g,购自基尔顿生物科技(上海),严格按照《实验动物管理条例》进行实验,动物许可证号:SYXK(上):2019-0075,温度15～18 ℃,湿度约为70%,每日12 h光照,喂养条件为自由摄取标准饲料,饮用干净自来水。

1.2 实验试剂与仪器 他克莫司(上海第一生化药业有限公司),阿司匹林(广州天心制药厂),伊红液(上海麦克林公司),白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)(上海酶联生物科技有限公司),无水乙醇(桂林中辉科技发展有限公司),干酪乳酸杆菌菌种(重庆天圣制药有限公司),心肌肌钙蛋白I试剂盒、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TUNEL)试剂盒(南京建成生物工程研究所),FEITecnai G12型透射电镜(美国强生公司),切片机(上海医用仪器厂),多普勒超声仪(日本Nikon公司),免疫印迹化学放光底物(北京化学试剂公司)。

1.3 动物模型建立 将干酪乳酸杆菌菌种(LCWE)接种于肉汤培养基中,在37 ℃厌氧环境下培养2 d,将培养基以3 000×g(重力加速度),离心30 min后弃上清,沉淀加入50 g/L十二烷基硫酸钠(SDS)过夜并裂解,以3 000×g离心裂解液30 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤后加RNA酶200 μg/mL混匀,37 ℃孵育2 h,离心弃上清后重复3次,再加入DNA酶200 μg/mL混匀,7 ℃孵育4 h,离心弃上清后重复3次,最后沉淀中加入胰蛋白酶200 μg/mL,37 ℃孵育4 h,离心弃上清后重复3次,以PBS将沉淀重悬,超声破碎仪冰上破碎2 h后5 ℃,8 000×g离心1 h,上清即为LCWE。采用比色法定量,并将LCWE终浓度稀释为1 mg/mL后,小鼠腹腔注射5 mg/kg剂量为川崎病建模成功。

1.4 动物分组与给药 所有小鼠适应性喂养1周后,随机分为正常组、模型组、阿司匹林组、他克莫司组,每组10只小鼠。正常组和模型组采用10 mg/kg羧甲基纤维素钠水溶液灌胃,阿司匹林组采用阿司匹林50 mg/kg灌胃,他克莫司组采用他克莫司40 mg/kg灌胃,均每日1次,连续干预10 d。

1.5 组织提取 每组选取5只小鼠进行眼眶静脉取血1 mL,于-80 ℃保存,用于生化指标检测。将小鼠麻醉后,采用脊椎脱臼法处死小鼠后,在无菌条件下迅速剪开皮肤,取出心脏后置于生理盐水中漂洗,采用5%多聚甲醛溶液进行固定,室温保存,制作病理切片。

1.6 观察指标

1.6.1 超声心动图检测小鼠心脏功能 采用200 g/L乌拉坦腹腔注射麻醉小鼠,备皮仰卧位固定,使用频率为7.0 MHz的探头对小鼠进行心脏超声检查,首先测量小鼠胸骨旁左心室短轴二维图像,在乳头肌水平位将M型取样线与室间隔-左心室后壁连线垂直,获得M型超声心动图,采用ASE法测量小鼠左室舒张末期内径(LVEDD),采用Teich-holtz公式计算左室射血分数(LVEF),LVEF(%)=[(LVEDD3-LVAWD3)/LVEDD3]×100%,其中LVAWD为左室前壁舒张末期厚度,每组原始数据取连续3个心动周期的平均值,超声检查操作及分析均采用双盲法。

1.6.2 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清IL-6、TNF-α、血管内皮生长因子(VEGF) 各组小鼠眼眶取静脉血1 mL后,以3 000 r/min离心15 min,留取上清液,在对应孔板中加入100 μL标准品工作液,37 ℃恒温孵箱孵育1 h,去板内液体后加入50 μL生物素化抗体工作液,37 ℃恒温孵箱孵育1 h,去板内液体后冲洗3次,洗涤结束后每孔加100 μL辣根过氧化物酶(HRP)结合物工作液,37 ℃恒温孵箱孵育30 min,取孔板反复冲洗板内液体,洗涤结束后每孔加入100 μL底物溶液,进行37 ℃恒温孵箱孵育15 min,每孔加入50 μL终止液,200 nm波长处检测OD值,根据标准曲线和OD值计算IL-6、TNF-α、VEGF含量。

1.6.3 苏木精-伊红(HE)染色 取小鼠心脏组织样品后经梯度浓度乙醇脱水,再置于二甲苯中透明,之后置入石蜡中包埋。使用切片机将组织切片,切片厚度为3 μm,染色前将石蜡切片置于二甲苯中脱去石蜡,采用10%中性甲醛固定后进行石蜡切片,依次由无水乙醇、90%乙醇、80%乙醇和80%乙醇梯度脱水后再用清水冲洗,在80 ℃烤箱中烘烤15 min后置于苏木素中染色15 min,清洗后伊红染色3 min,70 ℃烘箱烤干后用中性树脂封片。血管组织切片于显微镜下观察后拍照。

1.6.4 TUNEL检测小鼠心肌细胞凋亡率 将包埋好的心肌组织石蜡切片用冰冻机进行连续切片后进行TUNEL染色,严格按照试剂盒说明进行操作,将冰冻切片室温复温30 min,使用冰丙酮固定5 min,5 ℃ PBS进行冲洗3次,每次5 min,10%牛血清蛋白(BSA)室温封闭15 min,加入TUNEL混合液室温孵育1 h,5 ℃ PBS冲洗3次,每次5 min,荧光染料二脒基苯基吲哚(DAPI)核染1 min,4 ℃ PBS冲洗3次,每次5 min,切片染色后在显微镜下观察,凋亡细胞核呈绿色荧光,采用Image Pro Plus 5.0软件进行凋亡细胞计数,在500倍显微镜下随机取5个不同的视野,在每个视野中记录凋亡心肌细胞数及心肌细胞总数,计算心肌细胞凋亡率,取平均值。

1.6.5 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠心肌组织JAK2、STAT3蛋白表达 取小鼠心肌组织50 mg,加入0.15%胰蛋白裂解液,以4 000 r/min离心,10 min后取上清液,血清样品中加入样孔进行电泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜TBS浸泡15 min后PBS反复冲洗,每次5 min,分别加入JAK2(1∶500)、STAT3(1∶1 000)、β-actin抗体(1∶1 000),辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG作为二抗(1∶2 000),分别杂交后进行PBS冲洗,以β-actin为内参指标,采用显色剂进行显色和灰度扫描分析扫描条带,计算JAK2、STAT3蛋白表达量。

2 结 果

2.1 各组超声心动图改变 正常组小鼠心脏舒张功能正常、无障碍发生;模型组小鼠出现心脏舒张功能障碍,LVEDD增加,LVEF降低;他克莫司组LVEF有所提升,LVEDD相对减少;阿司匹林组小鼠心脏舒张功能略微缓解,LVEF、LVEDD改善。详见图1、表1。

表1 各组超声心动图LVEDD、LVEF比较(±s)

图1 各组超声心动图改变

2.2 各组小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量比较 与正常组比较,模型组血清TNF-α、IL-6、VEGF含量升高(P<0.05);与模型组比较,他克莫司组血清TNF-α、IL-6、VEGF含量降低(P<0.05);与他克莫司组比较,阿司匹林组小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量升高(P<0.05)。详见表2。

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF含量比较(±s) 单位:ng/mL

2.3 心肌组织HE染色 正常组小鼠心肌纤维排列整齐,细胞排列有序紧密,细胞核呈卵圆形,细胞质鲜红;模型组小鼠心肌纤维排列紊乱且心肌组织断裂和溶解,间质纤维化和组织坏死,细胞排列紊乱,出现水肿和坏死等,细胞核大小不均匀并有炎性浸润;他克莫司组心肌断裂组织及溶解有所缓解,细胞核排列趋于整齐,分布趋于有序、紧密;阿司匹林组心肌纤维排列紊乱现象有所缓解,部分区域仍有溶解及断裂现象。详见图2。

图2 各组心肌组织HE染色图(×200)

2.4 各组小鼠心肌细胞凋亡率比较 与正常组比较,模型组小鼠心肌细胞凋亡率升高(P<0.05);与模型组比较,他克莫司组小鼠心肌细胞凋亡率降低(P<0.05);与他克莫司组比较,阿司匹林组小鼠心肌细胞凋亡率升高(P<0.05)。详见图3、表3。

表3 各组心肌细胞凋亡率比较(±s) 单位:%

2.5 各组小鼠心肌组织JAK2、STAT3蛋白比较 与正常组比较,模型组心肌组织JAK2、STAT3蛋白表达降低(P<0.05);与模型组比较,他克莫司组心肌组织JAK2、STAT3蛋白表达升高(P<0.05);与他克莫司组比较,阿司匹林组心肌组织JAK2、STAT3蛋白表达降低(P<0.05)。详见图4、表4。

表4 各组小鼠心肌组织JAK2、STAT3蛋白比较(±s)

图4 各组JAK2、STAT3蛋白表达条带图

3 讨 论

川崎病是一种免疫介导的急性全身疾病,免疫系统的高度活化和免疫损伤性血管炎是川崎病的特点[6]。他克莫司属钙调蛋白磷酸酶抑制剂,其免疫抑制作用机制与环孢素A相似,可介导内皮功能,并抑制病灶部位新生血管生成[7]。细胞凋亡是一种受基因调控的细胞死亡,表现为凋亡中信号通路的启动及相关基因表达的变化。有研究显示,心肌细胞在某些病理状态下发生凋亡,且细胞凋亡的发生发展受多种基因调控,与相关信号的激活、转导具有一定相关性[8]。通过超声表现和组织声学特性间的相互关系,不仅能测定脏器的大小、运动、结构变化等,同时了解相关病理组织的改变及鉴别功能心肌的逆转、炎性浸润、纤维化等,在川崎病心肌诊断中具有重要意义[9]。本研究利用实时三维超声心动图对川崎病心肌功能的测定发现,正常组小鼠心脏舒张功能正常且无障碍产生,模型组小鼠出现心脏舒张功能障碍,LVEDD增加,LVEF降低,经他克莫司处理后的川崎病小鼠LVEF提升,LVEDD减少,经阿司匹林处理后小鼠虽然心脏舒张功能略微缓解,LVEF、LVEDD略改善,但相对弱于他克莫司组。表明经他克莫司干预后川崎病小鼠的心脏整体功能及局部收缩功能均可改善。

相关研究显示,TNF-α、IL-6、VEGF等炎性因子在川崎病的发生发展、心肌损伤及内皮功能中的表达具有重要的作用[10]。本研究结果显示,与正常组比较,模型组小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平较高;与模型组比较,他克莫司组小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平降低;与他克莫司组比较,阿司匹林组小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF水平升高,提示他克莫司可降低川崎病小鼠血清TNF-α、IL-6、VEGF表达。川崎病中相关因子通过增加细胞黏附分子表达,诱发血小板活化分子及IL-6等相关炎性因子释放,并通过自分泌方式作用于单核巨噬细胞,释放炎性介质加剧炎症反应,促进炎性细胞在机体内黏附、浸润及中性粒细胞脱颗粒、抗纤溶等,增加内皮损伤及动脉粥样硬化[11]。相关研究显示,他克莫司通过抑制机体内腺嘌呤核苷三磷酸发挥抗氧化作用,增加动脉血流量,增强心肌收缩功能,改善TNF-α、IL-6等表达,减轻炎症反应[12]。他克莫司通过下调近端小管上皮细胞VEGF表达,降低单核细胞的趋化作用,减轻平滑肌细胞增生及血管壁厚度、管腔狭窄、闭塞等引起的心脏供血功能不足,改善川崎病所致的炎细胞浸润及心肌细胞凋亡[13]。

川崎病引起的心肌细胞凋亡是受多种基因调控,其中凋亡加速基因Bax和凋亡抑制基因Bcl-2认为与细胞凋亡关系密切[14]。本研究结果显示,与正常组比较,模型组小鼠心肌细胞凋亡率升高;与模型组比较,他克莫司组小鼠心肌细胞凋亡率下降;与他克莫司组比较,阿司匹林组小鼠心肌细胞凋亡率升高,提示他克莫司可减轻川崎病小鼠心肌细胞凋亡。川崎病中Bcl-2基因家族成员可能通过相互竞争形成同型或异型的二聚体调控线粒体变化,间接调节蛋白酶和核酸酶活性,双向调节心肌细胞凋亡[15]。Bax与相关凋亡基因结合形成异型二聚体使Bax失活,同时Bcl-2被磷酸化并从二聚体中释放出来,游离的Bax可形成诱导细胞凋亡的同型二聚体,破坏线粒体膜功能,进而启动Caspase酶系级联反应,从而导致细胞凋亡[16]。有研究显示,他克莫司具有抗低氧再给氧心肌细胞凋亡作用,其机制可能与清除氧自由基和一氧化氮有关,通过增强细胞凋亡抑制基因Bcl-2水平,可改善心脏收缩和舒张功能,增加冠状动脉血流量,进而发挥抑制心肌细胞凋亡的作用[17]。

JAKs/STATs信号通路是细胞因子信号转导的重要途径,参与机体的免疫调节、细胞活性、肿瘤发展等[18]。以往研究表明,JAK2、STAT3表达异常引起心肌营养因子和信号转录激活因子及内皮功能改变,提示JAKs/STATs信号通路对川崎病引起的心肌功能发挥一定的干预作用[19]。本研究结果显示,与正常组比较,模型组小鼠心肌组织JAK2、STAT3蛋白表达降低;与模型组比较,他克莫司组小鼠心肌组织JAK2、STAT3蛋白表达升高;与他克莫司组比较,阿司匹林组小鼠心肌组织JAK2、STAT3蛋白表达降低,提示他克莫司可提高川崎病小鼠心肌组织JAK2、STAT3蛋白表达。相关研究显示,STAT通过与酪氨酸相关受体结合,与JAK及受体上酪氨酸残基发生反应,将吸引STAT结合到受体上,使磷酸化的JAK2、STAT3转位到细胞核内,抑制川崎病发生发展[20]。有研究显示,他克莫司可能通过多途径调节细胞因子释放和蛋白表达,减轻川崎病引起的机体不良反应,并介导JAKs/STATs使JAKs磷酸化下游的蛋白转录合成效应底物,抑制心肌细胞凋亡和促坏死因子[21]。

综上所述,他克莫司可改善川崎病小鼠心脏功能及内皮功能,降低心肌细胞凋亡,其作用机制可能与调控JAK2/STAT3信号通路有关。本研究存在一定的局限,今后应不断完善,以期为临床相关疾病的治疗提供实验依据。