携带遗传标记的新型鹅细小病毒感染樱桃谷北京鸭再现短喙与矮小综合征

李勇霖,王 昱,张 伟,周 扬,李玉峰,蒋志伟,张建军,朱国强,王建业*

(1.扬州大学 兽医学院 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,江苏 扬州 225009;2.国药集团扬州威克生物工程有限公司,江苏 扬州 225100;3.山东省农业科学院 家禽研究所,山东 济南 250023)

2015年,短喙与矮小综合征(short beak and dwarfism syndrome,SBDS)在中国的樱桃谷北京鸭中暴发,此后,此病陆续在国内的骡鸭、麻鸭等品种中也有发生[1-4]。2019年,SBDS在埃及和波兰开始流行,主要感染骡鸭和樱桃谷北京鸭[5-6]。SBDS是一种传染性疫病,在上世纪70年代已经在法国骡鸭中流行[7]。该病的特征性临床表现包括体型矮小、喙短、舌头外伸、跛脚、不愿走动,发病率通常在10%～30%之间,死亡率不到5%,至上市阶段,断腿断翅的比例明显升高[8]。该病在国内的出现给肉鸭养殖业带来了很大经济损失。

SBDS病原鉴定为鹅细小病毒(goose parvovirus,GPV)的变异株或称之为新型鹅细小病毒(novel goose parvovirus,NGPV)。研究显示,NGPV与经典型GPV之间拥有特征性的核苷酸和氨基酸差异[9]。经典型GPV对雏鹅具有高致病性,但在自然条件下,对樱桃谷北京鸭缺乏致病性。尽管已有报道表明用NGPV分离株感染樱桃谷北京鸭能够复制出SBDS,但在某些SBDS临床病例中,发现存在鸭圆环病毒和NGPV的共感染[10-11]。因此,是否单独的NGPV感染樱桃谷北京鸭能够复制出SBDS的所有临床症状尚存疑问。本研究中,基于NGPV分离株SDJN19,构建了包含其完整基因组的感染性质粒pJN,并引入单个核苷酸点突变作为遗传标记,质粒转染樱桃谷北京鸭胚拯救出感染性病毒rJNm。rJNm的鸭感染试验表明,单独的NGPV感染足以复制出典型的SBDS症状,且具有显著的水平传播能力。

1 材料与方法

1.1 病毒株和质粒NGPV毒株SDJN19由本课题组分离,-80℃保存;经过修饰的带有NcoⅠ酶切位点的pBSKN质粒由本课题组先前构建[12]。

1.2 试剂各种限制性内切酶均为NEB公司产品;转染试剂Lipofectamine 2000 购自Invitrogen;高保真聚合酶PrimeSTAR Max 购自TaKaRa;质粒纯化及胶回收试剂盒购自天根生物科技有限公司。

1.3 病毒增殖和纯化将SDJN19的种毒用灭菌生理盐水做1∶50稀释,并加入青、链霉素至终浓度各2 000 U/mL。病毒液以尿囊腔接种9日龄樱桃谷北京鸭胚,置于37.8℃孵化箱继续孵育,每天照蛋3次,48 h内死亡胚弃去。48 h后死亡胚,检出后置4℃放置6～10 h,收集死胚尿囊液,-20℃保存待用。病毒的纯化、浓缩及核酸提取参照文献[12]进行。核酸沉淀用30 μL STE(0.010 mol/L Tris、0.001 mol/L EDTA、0.100 mol/L NaCL, pH 8.0)溶解,然后置于95℃水浴作用5 min,再缓慢降温至50℃,使得单链核酸退火形成双股DNA分子,取10 μL进行琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4 感染性质粒pJN的构建及遗传标记引入取30 μL双股DNA,用NcoⅠ单酶切,产生3.8,1.2 kb 2个亚基因组片段。2个片段经1%琼脂糖电泳分离后,切胶回收DNA片段。将左侧3.8 kb 片段导入pBSKN 质粒的HincⅡ和NcoⅠ酶切位点之间,获得质粒pBSKN-3.8。右侧1.2 kb片段导入NcoⅠ和SmaⅠ位点之间,获得质粒 pBSKN-1.2。pBSKN-3.8用NcoⅠ和XhoⅠ双酶切,将回收的3.8 kb片段插入pBSKN-1.2质粒的NcoⅠ和XhoⅠ位点之间,最终获得包含整个基因组的质粒pJN。通过选择合适的酶切位点和Overlap PCR,在pJN质粒位于VP3基因区域的NdeⅠ位点中引入单个核苷酸点突变(A→G),但不改变密码子,修饰后的质粒定名为pJNm。所有连接产物均转化于大肠杆菌SURE株制备的感受态细胞。

1.5 pJNm转染和病毒拯救将pJNm质粒和转染试剂Lipofectamine 2000,按照1.0∶2.5的比例混合,静置20 min后将转染混合物以绒毛尿囊膜途径接种9日龄樱桃谷北京鸭胚,每个胚质粒用量为2.0 μg。同时以转染载体质粒pBSKN作为同步对照。对48 h 后死亡的鸭胚,收集尿囊液并检查胚体病变。将上述收集的尿囊液做1∶50稀释,经尿囊腔途径接种5个9日龄樱桃谷北京鸭胚,每个胚0.2 mL,收集48 h后的死亡胚胎尿囊液,-80℃保存。如此传代2次,将拯救的病毒命名为 rJNm。

1.6 rJNm基因组序列分析和ELD50测定从尿囊液中提取rJNm病毒核酸,参照SDJN19的基因组序列(GenBank登录号MN356044),设计5对重叠PCR引物,扩增rJNm基因组。PCR产物切胶回收后,送商业化公司进行测序,并与亲本株SDJN19序列进行比对。将拯救病毒rJNm和亲本株SDJN19分别做10倍梯度稀释,每个梯度接种5个9日龄樱桃谷北京鸭胚,0.2 mL/胚,连续观察7 d,每天照胚3次,记录死亡个数和死亡时间,按照Reed-Muench方法计算半数致死量(ELD50)[13]。

1.7 雏鸭感染试验将2日龄樱桃谷北京鸭分为2组,每组20只,分别饲养于隔离器中,自由饮食和饮水。感染组经颈部皮下接种0.5 mL的rJNm,包含2.5×105ELD50。对照组鸭给予正常发育至14日龄的樱桃谷北京鸭胚尿囊液,0.5 mL/只。饲养观察32 d,在感染后7,14,21,28 d,分别测量体质量、喙长和喙宽,对死亡鸭和存活鸭扑杀后予以剖检,观察病理变化,并做显微组织学检查。

1.8 水平传播试验设置3个组别,分别为感染组、水平接触组和对照组,每组9只2日龄樱桃谷雏鸭。感染组和水平接触组饲养于同一间房的不同笼子,笼间距为10 cm,房间及笼子内部空气自由流通。对照组饲养于单独房间。感染组鸭颈部皮下接种rJNm,剂量为2.5×105ELD50。3组鸭饲养观察32 d,自由采食饮水。在感染后7,14,21,28 d分别测量体质量、喙长、喙宽。对死亡病例及存活鸭予以剖检,观察病理变化,并做显微组织学检查。

1.9 病毒载量分析和抗体检测对水平接触组中31 d仍存活的鸭扑杀后,取其肝脏、脾脏和回肠,进行病毒载量分析和PCR鉴定,并与感染组中死亡鸭进行比较。qPCR上游引物为5′-caatgttggtcttcccggtgg-3′,下游引物为5′-agtatcctgtgcggctgggtg-3′。qPCR引物靶向NGPV Rep1基因,扩增片段为95 bp。通过琼脂扩散试验对31 d存活鸭的血清抗体水平进行检测,以出现沉淀线的血清最大稀释倍数以2为底数的负对数值表示为血清抗体效价。以SDJN19株鸭胚尿囊液浓缩50倍作为琼扩抗原。

2 结果

2.1 pJN构建通过对1.2,3.8 kb亚基因组片段进行克隆和组合,获得包含SDJN19完整基因组的质粒pJN。pJN用SphⅠ单酶切产生3.3,2.5,2.2 kb 3条DNA片段,用XhoⅠ和BamHⅠ双酶切后产生3.0 kb载体分子和5.0 kb插入的基因组(图1)。

A.pJN 酶切鉴定(M.1 kb DNA Marker;1.SphⅠ单酶切产生3.3,2.5,2.2 kb DNA片段;2.XhoⅠ和BamHⅠ双酶切产生3.0 kb的pBSKN载体和5.0 kb插入基因组);B.pJN示意图及主要酶切位点分布

2.2 产生携带遗传标记的rJNm为了产生区别于野毒株的拯救病毒,在pJN质粒VP3基因内部NdeⅠ位点,通过Overlap PCR引入了1个同义核苷酸突变(A→G),产生质粒pJNm。pJNm转染9日龄樱桃谷北京鸭胚,胚在120～136 h之间死亡,检查胚体可见明显充、出血。转染载体质粒pBSKN的鸭胚均存活。第1代拯救的病毒尿囊液传代后可以稳定在96～120 h致死樱桃谷北京鸭胚。拯救病毒以rJNm表示。

2.3 rJNm基因组序列分析和ELD50测定对盲传2代的rJNm基因组进行PCR扩增和序列分析,结果显示,除人工引入的遗传标记位点之外,rJNm与亲本株SDJN19序列完全一致。对rJNm和亲本株SDJN19的ELD50分别进行测定,结果显示rJNm的ELD50达到5×106.25/mL,而亲本株SDJN19的ELD50为5×105.38/mL。这表明拯救病毒rJNm具有与亲本病毒相近的ELD50。

2.4 rJNm的樱桃谷北京鸭感染试验与对照组相比,感染组自第1周开始,生长速度就明显放缓。在感染后7,14,21,28 d的体质量分别为0.137,0.261,0.434和0.609 kg,而对照组体质量则达到0.349,0.764,1.271 和1.656 kg,组间差异显著(P<0.000 1)(图2A)。感染组鸭喙的发育同样受到抑制,在7,14,21,28 d,其喙长和喙宽均明显低于对照组(P<0.000 1)(图2B、C)。感染鸭不愿走动,大多时间呈蹲伏状态,很快这些鸭站立和走动愈发困难,跛脚,可见单只或2只腿后伸或向外呈劈叉姿势(图2E)。随着病程发展,在感染鸭中出现死亡病例,观察期内总共8只鸭死亡,第1例出现在感染后7 d,最后1例在第15 天,总死亡率为40%(图2D)。由于喙短,大多数鸭舌头向外伸出、向下弯曲,在感染后第3周表现得尤为明显。跖骨靠近关节处由于长期磨损,外观上表现为红肿(图2E)。其他可见症状还有拉稀、换羽延迟,与对照组鸭相比叫声低沉。无论在死亡鸭还是存活鸭,均无可见的神经症状。

对死亡鸭进行解剖,主要病理变化体现在充、淤血,可见于肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、胰腺和心肌表面。腺胃和食道黏膜表面可见多量的灰白色黏液附着,胆汁暗绿色。十二指肠段外观略显松弛,肠黏膜变薄,内有少量黄色炎性分泌物。对28 d仍存活的鸭进行了组织病理学检查,结果显示在肝脏、脾脏、十二指肠、空肠、回肠、心肌、脑、胸腺、肺脏、腺胃、法氏囊等器官组织中均未见有明显的显微病理学改变。

A～C.感染鸭体质量、喙长、喙宽的变化;D.不同时间点鸭的死亡个数;E.感染鸭的临床表现

2.5 rJNm的水平传播试验水平接触组鸭的体质量,在感染后7,14,21,28 d均低于对照组(P<0.01),但高于感染组(P<0.05)。感染后7 d喙长与对照组差异不显著,在14,21,28 d则低于对照组(P<0.01)(图3A)。感染后28 d,水平接触组鸭喙长只有4.22 cm,感染组为4.08 cm,两者间差异不显著(P>0.05),而对照组喙长则为5.67 cm(图3B)。水平接触组鸭喙宽在4个测量时间点始终低于对照组,感染后28 d的喙宽为2.46 cm,低于对照组(2.87 cm),但高于感染组(2.16 cm),差异均显著(P<0.05)(图3C)。整个观察期,在水平接触组未见死亡病例,6只鸭的舌头明显外伸,占比67%,感染后28 d尤为明显(图3D)。与对照组相比,水平接触组鸭站立仍不够持久、喜蹲伏,叫声低沉。对水平接触组鸭于感染后29 d进行剖检,没有发现特征性眼观病理变化,主要内部器官中也未观察到任何显微组织学病理变化。

A～C.水平接触组鸭的体质量、喙长和喙宽;D.水平接触组鸭舌头外伸、向下弯曲

2.6 病毒载量和血清抗体检测对水平传播试验中感染组和水平接触组的肝脏、脾脏、回肠的病毒载量进行了分析比较。在感染后31 d,水平接触组鸭脾脏的病毒载量达到109.1/g,而感染组中死亡鸭的脾脏病毒载量为108.9/g,两者间差异不显著(P>0.05)(图4A)。水平接触组鸭的肝脏、回肠的病毒载量分别为106.5/g和108.2/g,低于感染组中死亡鸭(P<0.01),后者肝脏和回肠的病毒载量分别为108.8/g和109.7/g。进一步的PCR扩增结果显示,从水平接触组鸭的脾脏、回肠提取的核酸模板中均能特异性的扩增出约800 bp片段,肝脏样品未能扩出条带(图4B)。序列分析显示,除了作为遗传标记位点的突变外,扩增序列与亲本株SDJN19完全一致(图4C)。试验结果表明rJNm可以通过水平接触感染樱桃谷北京鸭。通过琼脂扩散试验对血清抗体进行检测,感染后31 d,水平接触组中9只存活鸭的琼扩效价平均值为5.38,而感染组存活的6只鸭的琼扩效价平均值为4.83(图4D)。结果表明水平接触组鸭已经激发了高水平的针对NGPV的血清沉淀抗体。

3 讨论

自SBDS在我国暴发以来,发现在部分临床病料中存在NGPV和鸭圆环病毒的共感染[10],因此,NGPV单独感染是否足以引发SBDS的所有临床症状尚需要进一步澄清。本研究中,通过反向遗传学技术,构建了带有遗传标记的病毒rJNm。人工感染及水平传播试验结果均表明,单独的NGPV感染樱桃谷北京鸭能够复制出SBDS的所有特征性临床症状。在雏鸭感染试验中,累计死亡率40%,但从感染后7 d才出现死亡病例,到感染后15 d出现最后1例死亡病例,中间间隔8 d,并且这些鸭从出现站立、行走困难到死亡多需要数天时间。相比之下,经典型GPV人工感染2日龄雏鹅,多呈现急性死亡特征[14]。这表明NGPV和经典型GPV对各自宿主存在着明显的致病性差异和不同的致病特征。水平传播试验还表明NGPV具有明显的水平传播能力,至感染后28 d,水平接触组多数鸭呈现出SBDS的所有典型特征,如喙短、舌头外伸、增重缓慢、发声低沉等,但这些鸭无一死亡,这与田间患上SBDS的樱桃谷北京鸭死亡率极低、但感染率相对较高(10%～30%)的特征相符合[8]。

A.水平接触组感染后31 d存活鸭和感染组中死亡鸭的病毒载量比较;B.水平接触组存活鸭内脏器官核酸样本的PCR扩增(M.DL2000 DNA Marker;1,4.肝脏;2,5.脾脏;3,6.回肠);C.样品扩增序列与亲本株SDJN19相比较;D.水平接触组鸭和感染组存活鸭的血清琼扩抗体测定

通过荧光定量PCR,对感染试验中死亡及存活鸭的脏器病毒载量进行了分析比较。水平接触组31 d存活鸭的脾脏病毒载量仍能达到109/g,与死亡鸭的病毒载量(108.9/g)基本处于同一水平。这提示NGPV人工感染中死亡的鸭,与高病毒血症可能并无直接关联。由于NGPV感染对鸭的骨骼发育造成的影响尤为突出,表现为站立、行走困难和喙畸形,这些症状的出现对鸭采食、饮水带来极大不利,增加了死亡概率。麻疹病毒、犬瘟热病毒感染导致人的骨质代谢异常引发的疾病已有报道[15-16],但NGPV感染是如何影响鸭骨质代谢相关信号通路,进而直接影响骨骼发育,尚需进一步深入研究。

本研究还表明,NGPV对樱桃谷北京鸭具有持续性感染的一面。检测发现,31 d水平接触组所有存活鸭体内呈现了高水平血清沉淀抗体,平均效价在5log2以上。尽管如此,在这些鸭的脾脏、回肠及肝脏中仍能检出较高的病毒载量,尤其是脾脏病毒载量和死亡鸭脾脏中病毒载量几无差异。通过常规PCR,从这些存活鸭的脾脏、回肠样品中能扩增出清晰核酸条带。对扩增靶片段的测序结果显示,除了引入的遗传标记,其余核苷酸序列与亲本株SDJN19完全一致。这些结果表明,NGPV感染樱桃谷北京鸭诱导产生的血清沉淀抗体不足以阻断和清除NGPV在体内的复制,表现为持续性感染。已知在细小病毒科成员中,水貂阿留申细小病毒和B19细小病毒能够分别在水貂和人引起慢性、持续性感染[17-18]。NGPV在樱桃谷北京鸭上产生持续性感染的机制值得进一步深入研究。由于樱桃谷北京鸭商品代通常在40 d左右即可上市,因此感染了NGPV的鸭很可能持续排毒至上市前。由于GPV为无囊膜病毒,对外界环境抵抗力强,在“全进全出”饲养模式下,为控制SBDS的早期感染和传播,对饲养场地的严格消毒就显得格外重要。

总之,本研究证实单独的NGPV感染樱桃谷北京鸭可以复制出典型的SBDS症状,且NGPV具有显著的水平传播和持续性感染能力。本研究结果为进一步探索NGPV致病机制奠定了基础。