影响透明质酸炎症反应的因素：杂质、细胞种类和分子量大小

孙欣 王瑞妍

关键词：透明质酸；炎症；杂质；细胞种类；分子量

透明质酸是一种天然的直链聚合物，属于糖胺聚糖的一种，是细胞外基质的重要组成部分[1]。它由D- 葡萄糖醛酸和N- 乙酰基-D- 葡萄糖胺的重復二糖单元组成，通过交替的β-1，3 和β-1，4 糖苷键连接，具有亲水性[2]。在其天然形式中，透明质酸一般表现为非常长的聚合物，称为高分子量透明质酸。在某些条件下，高分子量透明质酸可以被分解成小片段，称为低分子量透明质酸[3]。各种研究文献对于划定透明质酸分子量高低并无明确的界限，本文以不同分子量可能介导不同的炎症反应为依据[4]，认为高分子量透明质酸大于500 kDa，低分子量透明质酸分子量为10 ～ 500kDa，而小于10kDa 则为寡聚透明质酸。

对于低分子量透明质酸和寡聚透明质酸是否有促炎作用已经引发了广泛的关注和争议。有研究发现，在受到刺激后的巨噬细胞中加入不同分子量大小的透明质酸后，并不能检测到任何促炎症因子、一氧化氮和α 型肿瘤坏死因子（TNF-α） 的产生[5]。另一项研究发现，低分子量和高分子量透明质酸并不会引起肾小球系膜细胞的炎症反应；但如果采用透明质酸酶来处理加入的透明质酸并使之降解，则会使透明质酸覆盖的细胞膜表面炎症因子受体（如TOLL 样受体） 暴露出来，使得细胞更容易受到促炎分子（如内毒素） 的影响[6]。此外，将低分子量透明质酸（200kDa） 或人重组透明质酸酶加入无内毒素的透明质酸中，两者之一施用到小鼠皮下气囊中后，并不会在灶点引发炎症反应[7]。以上这些结果均不支持低分子量或寡聚透明质酸具有促炎作用的观点。

另外，透明质酸或其他试剂中的杂质或污染物，被发现可能导致实验给出误导性的结果。例如低至5 pg/mL的微量内毒素就可以诱导小鼠树突状细胞产生促炎性的白细胞介素-6（IL-6）[8]。目前，有两种生产工艺可用于获得商业化的透明质酸：从动物组织中提取，或者通过生物合成的方式获得。这两种方法都面临着使用源自动物或链球菌的生物制品安全性问题，而链球菌作为一种已知的病原体，会产生内毒素，成为透明质酸的潜在污染源[9]。其他研究者也指出，透明质酸和透明质酸酶（如牛源或溶透明质酸链霉菌源等） 是两个很容易被内毒素污染且被广泛用于透明质酸炎症反应研究的试剂[10，11]。透明质酸酶被用于各种分子量透明质酸的降解以获得小分子片段。如果不对最终测试物质进行内毒素控制和检测，促进炎症的结果就可能是由内毒素而非透明质酸导致。如此一来，结论就存在被误导的风险。已有研究证实，不含内毒素的、由外源性添加的各种分子量透明质酸或者片段化透明质酸在离体小鼠巨噬细胞和树突状细胞中均不能引发促炎反应[11]。

本文将基于透明质酸介导炎症反应的机理，探究杂质、细胞种类和分子量大小对透明质酸介导炎症反应的影响。

01透明质酸介导炎症反应的机理

透明质酸根据两种基本机制发挥其生物功能：（I）作为细胞外基质中的结构分子和（II）作为信号分子[12]。

高分子量透明质酸作为细胞外基质中的结构分子，由于其大分子尺寸、显著的吸湿性，能够调节细胞外基质的组织水合作用和渗透平衡，构建一个水合和稳定的细胞外空间，在这里细胞、胶原蛋白以及其他细胞外基质组分得到牢固的维持[11]。高分子量透明质酸有助于维持细胞和组织的稳态。

而当透明质酸与结合分子相互作用时，它也起到信号分子的作用。与透明质酸相关的结合分子主要有两种：CD44 和CD168 （也称RHAMM，即透明质酸介导的运动受体）[13]。其他被发现的相关结合分子还包括细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、透明质酸内吞受体（HARE）、淋巴管内皮受体-1（LYVE1）、TOLL 样受体-2（TLR2） 和TOLL 样受体-4（TLR4） 等[11，14]。

CD44 作为一种淋巴细胞黏附受体，被广泛表达在各种免疫细胞表面，参与机体的炎症反应，炎症相关的细胞增殖、黏附和迁移，以及血管生成和细胞骨架重排[15]。透明质酸与CD44 的结合力随着透明质酸分子链变长而增加[16]，而当透明质酸的单糖数量低于20 个，与CD44 的结合方式便会发生变化[17]。透明质酸通过与CD44 结合，在细胞表面形成覆盖膜，该保护层能够掩盖住细胞的免疫受体，从而屏蔽掉炎症因子，防止细胞凋亡[3]。

CD168 存在于细胞表面、细胞质和细胞核中。细胞外侧的CD168 与蛋白酪氨酸激酶受体（RTKs） 和非蛋白酪氨酸激酶受体（包括CD44 和CD44-EGFR 复合物） 相互作用，通过激活ERK1/2/MAPK 信号通路介导炎症反应[12]。透明质酸与CD44 和CD168 的相互作用可以诱导多种细胞行为，包括激活酪氨酸激酶、蛋白激酶C、FAK和PI3K、MAPK、NF-κB 和RAS，以及激活炎症反应所需的细胞骨架成分[12]。上述细胞行为也可以由CD44 和CD168 各自独立地与透明质酸相互作用完成[12]。

此外，透明质酸还可以与特定的细胞因子相互作用，从而调节免疫细胞功能。一个例子是白细胞介素-8（IL-8），它在炎症存在时由成纤维细胞、单核细胞/ 巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞释放。透明质酸与IL-8 具有较弱的结合力，会降低IL-8 的活性。这意味着透明质酸可以适当屏蔽掉IL-8 引发的免疫反应[18]。

02影响透明质酸介导炎症反应的因素

影响透明质酸介导炎症反应的因素，已有研究报道的包括：透明质酸的分子量大小[19]，透明质酸内毒素的含量[10][20]、细胞受刺激的状态[19]，以及各种细胞种类。

本文对透明质酸在细胞层面的炎症测试文献进行了梳理，选择促炎因子（如TNF-α） 和抑炎因子作为衡量指标，通过汇总透明质酸对两者是否有显著的促进或者抑制作用，从而判断各个因素对透明质酸介导炎症反应的影响。

2.1 细胞类型对于透明质酸炎症反应的影响

表 1 总结了免疫细胞（巨噬细胞和外周血单个核细胞）、角质细胞和成纤维细胞，在正常条件和受刺激条件下，透明质酸介导的炎症反应。具体的数据汇总参见表 2 ～表7。很明显，不同细胞类型下，透明质酸呈现出不同的炎症反应。比如，角质细胞对各种分子量的透明质酸都不会产生促炎反应，而这些透明质酸在正常的成纤维细胞中却很可能引发炎症反应。值得一提的是，由于寡聚透明质酸对正常角质细胞没有炎症反应，而对于炎症状态的角质细胞（比如紫外刺激后） 能减缓炎症反应，因此可能很适合用来涂抹在皮肤表面，用于抗炎修复。

2.2 内毒素含量对于透明质酸炎症反应的影响

内毒素也被称为脂多糖（LPS），它是所有革兰氏阴性细菌细胞壁的内源性成分，对大多数哺乳动物都有“毒性”作用。LPS 是一种非常有效的炎症反应刺激物，在微克/升的濃度范围内即可以有生物活性[25，26]。大量关于寡聚、低分子或者片段透明质酸具有促炎作用的文章都是基于透明质酸降解实验，而降解过程中被广泛使用的试剂（如透明质酸酶） 或方法容易被内毒素污染，但一些研究并没有对降解后透明质酸的内毒素进行控制或检测，这使得所谓寡聚、低分子或者片段透明质酸具有促炎作用时常缺少说服力[27-29]。

内毒素会产生促炎症反应是公认的事实。根据美国FDA 要求，每件非特殊移植性医疗器械的内毒素上限是20 EU。目前各大透明质酸供应商都会严格控制内毒素含量，使之处于安全上限以下。表8 列出了已被报道的透明质酸介导炎症反应与内毒素含量的关系，由于此处内毒素含量是上限，实际透明质酸的内毒素含量可能远低于展示的数值，这使得分析内毒素含量与透明质酸介导炎症反应的关系变得困难和不甚可靠。表8 里列出的最低内毒素上限是0.01EU/mg；在此上限下，依旧发现透明质酸不论分子量大小，都存在促炎反应。另外，从机理上说，相比较高分子量透明质酸，低分子量透明质酸更加无法覆盖和屏蔽细胞膜上的促炎因子受体，因此相同含量的内毒素在低分子量透明质酸下可能会更容易触发细胞的炎症反应。有研究发现，低分子量透明质酸对LPS 处理的软骨细胞有增强炎症因子产生的作用，中等分子量透明质酸对LPS处理的软骨细胞产生炎症因子没有影响，而高分子量透明质酸对LPS 处理的软骨细胞能够降低炎症反应[30]。

表8 所示为不同的透明质酸内毒素含量下，加入透明质酸和不加透明质酸后，细胞促炎因子（或相关mRNA 表达） 的变化和抑炎因子（或相关mRNA 表达） 的变化。

03结论

透明质酸介导的炎症反应，既与透明质酸本身的类型和纯度相关，也与试验研究所用的细胞类型等实验条件相关。

在角质细胞、外周血单个核细胞、星形胶质细胞[31] 等细胞模型中，无论分子量大小，透明质酸都不会促发炎症反应。寡聚透明质酸对于UVB 损伤的角质细胞还具有减轻炎症反应的作用。而在成纤维细胞、巨噬细胞、软骨细胞[20][32][38]、人细支气管上皮细胞[33] 等细胞模型下，透明质酸介导炎症反应则复杂得多。通过整理分析巨噬细胞相关的论文发现，似乎高分子量透明质酸更倾向于抑制炎症，而低分子量透明质酸则更容易加剧炎症反应。但是也有研究表明寡聚和低分子量透明质酸并没有促炎作用[34，35]。巨噬细胞不同的极化（或激活） 状态对透明质酸会产生不一样的反应[19]。许多刺激物（如LPS 或干扰素γ） 具有激活巨噬细胞的能力，但即使是具有大致相同表型的刺激物（LPS 或干扰素γ 与LPS） 也会导致不同的细胞激活状态，进而影响数据结果。诸多巨噬细胞实验之所以会产生各自矛盾的结论，实验模型的差异可能是其中一个很重要的原因。

内毒素作为一种容易混入透明质酸的杂质在商业化生产中已经可以被很好地控制在安全上限以下。从发表的研究来看，在使用商业化的透明质酸所做的实验中，并没有证据表明内毒素含量与透明质酸介导的炎症反应存在相关性。但是也有研究表明，相同含量的内毒素在较低分子量的透明质酸中更容易刺激细胞产生炎症反应。因此，对低分子量或寡聚透明质酸进行更严格的内毒素控制显得很有必要。