西藏4种杜鹃属植物内生真菌群落组成及多样性分析

王素娟　常子惠　张永娟　卫波宁　德吉

摘要［目的］挖掘西藏杜鵑花科杜鹃属植物内生真菌资源，研究米林杜鹃（Rhododendron mainlingense）、髯花杜鹃（R.anthopogon）、雪层杜鹃（R.nivale）和雪山杜鹃（R.aganniphum）内生真菌的群落组成及多样性。［方法］采用组织分离法对上述4种杜鹃的根、茎、叶和花内生真菌进行分离，用ITS分子标记方法进行菌株鉴定。［结果］西藏4种杜鹃属植物720个组织块中分离得到336株内生真菌，这些真菌被鉴定为2门5纲10目16科21属55种。4种杜鹃属植物内生真菌多样性指数无显著差异。雪山杜鹃（H′=1.96，D=0.80）和雪层杜鹃（H′=1.81，D=0.77）内生真菌Shannon多样性指数（H′）和辛普森指数（D）高于髯花杜鹃（H′=1.36，D=0.71）和米林杜鹃（H′=1.17，D=0.65）内生真菌多样性。根、茎、叶、花不同部位内生真菌多样性也无显著差异。不同部位的H′和D指数分别为根部H′=2.63、D=0.86，茎H′=2.35、D=0.83，叶H′=2.26、D=0.80，花H′=2.23、D=0.83。［结论］研究结果为挖掘杜鹃中内生真菌资源和药效物质筛选研究提供了基础数据。

关键词杜鹃；内生真菌；群落组成；多样性

中图分类号Q948.1文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）11-0138-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.034开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Analysis on the Community Composition and Diversity of Endophytic Fungi in Four Species of Rhododendron in Tibet

WANG Su-juan CHANG Zi-hui ZHANG Yong-juan et al（1.School of Science，Tibet University，Lhasa，Tibet 850000;2.Agriculture Research Institute， Tibet Academy of Agriculture and Animal Husbandry Sciences，Lhasa，Tibet 850000）

Abstract［Objective］To explore the endophytic fungal resources of Rhododendron genus in the Rhododendron family in Tibet， and to study the community composition and diversity of endophytic fungi in Rhododendron mainlingense， R. anthopogon， R. nivale and R. aganniphum.［Method］The endophytic fungi from roots， stems， leaves and flowers of four species were isolated using tissue isolation method and identified by ITS sequencing.［Result］A total of 336 endophytic fungi were isolated from 720 tissues blocks of 4 species of Rhododendron plants in Tibet. These fungi were identified as 55 species belonging to 2 phyla， 5 classes， 10 orders， 16 families， 21 genera and 55 species.There was no significant difference in the diversity index of endophytic fungi among the four Rhododendron species.The diversity shannon index （H′） and simpson index（D） of endophytic fungi in R. aganniphum （H′=1.96，D=0.80） and R.nivale （H′=1.81， D=0.77） were higher than in R.anthopogon （H′=1.36， D=0.71） and R. mainlingense （H′=1.17，D=0.65）. There was no significant difference in the diversity of endophytic fungi in different parts of roots， stems， leaves and flowers.The H′ index and D index in different tissues as follows：H′=2.63， D=0.86 in roots， H′=2.35，D=0.83 in stems， H′=2.26，D=0.80 in leaves and H′=2.23，D=0.83 in flowers. ［Conclusion］The research results provide basic data for the exploration of endophytic fungal resources and screening of pharmacological substances in Rhododendron.

Key wordsRhododendron;Endophytic fungi;Community composition;Diversity

杜鹃属（Rhododendron L.）是杜鹃花科（Ericaceae）植物，其中米林杜鹃（Rhododendron mainlingense）、髯花杜鹃（R.anthopogon）、雪层杜鹃（R.nivale）和雪山杜鹃（R.aganniphum）主要分布于海拔2 700～5 800 m的高山地区［1］。据文献记载［2-4］，杜鹃根、茎、叶、花和果均可入药，根部具有祛风止痛、消肿散瘀、止咳等功效，可用于治疗跌打损伤、风寒湿痹、癣疮；叶具有解毒、清热和止血的功效；花具有除湿祛风、化瘀止痛的疗效；果实具有祛风镇痛、平喘止咳、化瘀消肿等功效。杜鹃可用于治疗炎症相关的疾病，如支气管炎、风湿病、关节炎等。

药用植物内生真菌是植物微生态系统中的重要组成部分，植物内生真菌是生活在植物细胞中或在其生活史某一时期生活在植物组织内，不引起植物发生明显病变的一类真菌［5-8］。有的内生真菌与植物生长密切相关，影响着植物种子的萌发，可促进植物生长和竞争力。有的内生真菌具有合成宿主次生代谢产物的能力［9-12］，同时植物真菌群落与寄主之间的相互作用是植物适应环境的重要因素［13-14］。自短叶红豆杉内生真菌中得到紫杉醇［15］以来，挖掘、筛选其他植物内生真菌药效物质已成为重要的研究方向。已有报道西藏米拉山雪层杜鹃中分离得到了4属内生真菌，分别为曲霉属（Aspergillus）、拟隐壳孢属（Cryptosporiopsis）、镰刀菌属（Fusarium）、壳多胞菌属（Stagonospora）［16］。但是，杜鹃种间内生真菌的差异和不同部位的内生真菌差异目前鲜见报道。该研究通过ITS分子标记方法对采集于西藏地区的4种杜鹃属植物的内生真菌进行鉴定与分析，比较不同种杜鹃之间内生真菌多样性，为挖掘杜鹃植物内生真菌资源以及筛选药效物质提供前期数据。

1材料与方法

1.1杜鹃花属植物内生真菌的样品采集于2021年6—8月在西藏不同地區采集杜鹃属全株新鲜植物，采样信息见表1。每个采样点选取新鲜健康植株6株，样品采集后放置于4 ℃冰箱，待处理。

1.2杜鹃属植物内生真菌的分离纯化及保存将采集的新鲜杜鹃植物的根、茎、叶、花用无菌水冲洗干净。用已灭菌的解剖刀将根、茎、叶和花所需部分切成小块，其中根部组织192块、叶部组织192块、茎部组织192块、花部组织144块。在无菌条件下将切好的植物材料置于75%乙醇浸泡2 min后，用无菌水冲洗3次，再用1%次氯酸钠溶液浸泡3 min后，无菌水冲洗3次，然后将植物横截面贴入PDA培养皿（已加Amp和Kan抗生素）中培养3～7 d。每隔1 d观察，将植物组织块周围长出的不同菌落分离，接种到新的PDA 固体培养基中，分离纯化3次，得到纯化的菌落。用组织块印迹法和无菌水检测法作为对照，来检验植株表面消毒情况。

1.3杜鹃属植物内生真菌的鉴定通过改良的CTAB法［17］提取杜鹃属植物内生真菌的DNA。用通用引物ITS1（5′-TCCG TAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）进行扩增。扩增条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，52 ℃复性45 s，72 ℃延伸90 s，重复35次，72 ℃延伸10 min，4 ℃低温保存。将PCR反应得到的产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程（成都）股份有限公司进行测序，测序后获得的ITS序列在NCBI中用BLAST 进行同源性序列比对，以此进行内生真菌的鉴定。

1.4内生真菌群落多样性分析通过Shannon多样性指数（Shannon-Weiner diversity index，H′）、辛普森指数（Simpson，D）、均匀度指数（evenness，E）、定殖率（colonization rate，CR）、分离率（isolation rate，IR）和分离频率（isolation frequency，IF）［18-23］分析杜鹃内生真菌的群落组成和多样性。该研究分别采用R语言、Origin 2021和Excel软件对杜鹃属植物内生真菌进行分析和绘图。

2结果与分析

2.1杜鹃花属植物内生真菌种类杜鹃属植物720个组织块中分离得到336株内生真菌，经过分子生物学鉴定，将336株内生真菌鉴定为子囊菌门、毛霉菌门2门，毛霉菌纲、座囊菌纲、粪壳菌纲、散囊菌纲、锤舌菌纲5纲，10目16科21属55种（表2）。

2.2杜鹃花属植物不同组织内生真菌的群落组成从图1可以看出，4种杜鹃属植物根部组织192块中分离出93株内生真菌，隶属于13属，其优势属为曲霉属Aspergillus（40.86%）、白僵菌属Beauveria（19.35%）和青霉属Penicillium（16.13%）。茎部组织192块中分离出94株内生真菌，其优势属为曲霉属（37.23%）、白僵菌属（25.53%）和青霉属（25.53%）。叶部组织192块分离出80株内生真菌，其优势属为白僵菌属（38.75%）、青霉属（28.75%）和曲霉属（21.25%）。花组织144块中分离出69株内生真菌，优势属为曲霉属（33.33%）、白僵菌属（30.43%）和青霉属（23.19%）。

研究结果还发现根部组织特有属为锥毛壳属Coniochaeta（2.15%）、弯胞属Curvularia（1.08%）、炭球菌属Daldinia（4.30%）、脉孢菌属Neurospora（1.08%）、鳞翅虫草属Samsoniella（1.08%）、篮状菌属Talaromyces（3.21%）和壳囊孢属Cytospora（2.15%）。茎组织特有属为略氏端隔孢壳菌属Apiospora（1.06%）和假散囊菌属Pseudeurotium（1.06%）。叶组织特有属为枝孢霉属Cladosporium（1.25%）、亚隔孢壳属Didymella（1.25%）和绿僵菌属Metarhizium（2.50%）。花组织特有属为毛壳属Chaetomium（1.45%）。

4种杜鹃属植物根、茎、叶、花组织内生真菌优势种都是曲霉属、白僵菌属和青霉属（图2）。米林杜鹃中分离出41株内生真菌，分为4属，分别为链格孢属（Alternaria）、曲霉属、白僵菌属和青霉属；髯花杜鹃分离出67株内生真菌，分为5属，分别为链格孢属、曲霉属、白僵菌属、青霉属和篮状菌属；雪层杜鹃分离出119株内生真菌，分为10属，分别为放射毛霉属（Actinomucor）、链格孢属、曲霉属、白僵菌属、青霉属、附球菌属（Epicoccum）、绿僵菌属、毛霉属（Mucor）、鳞翅虫草属和木霉属（Trichoderma）；雪山杜鹃分离出99株内生真菌，分为17属，分别为链格孢属、略氏端隔孢壳菌属、曲霉属、白僵菌属、枝孢霉属、锥毛壳属、弯胞属、毛壳属、壳囊孢属、炭球菌属、亚隔孢壳属、青霉属、脉孢菌属、假散囊菌属、附球菌属、毛霉属和木霉属。

4种杜鹃属植物根、茎、叶、花组织内生真菌的特有属共有12属，分别是枝孢霉属 、锥毛壳属、弯胞属、炭球菌属、亚隔孢壳属、绿僵菌属、脉孢菌属、假散囊菌属、鳞翅虫草属、篮状菌属、毛壳属和壳囊孢属。在根部组织中，链格孢属和篮状菌属为髯花杜鹃的特有属，锥毛壳属、弯胞属、炭球菌属、附球菌属、脉孢菌属和壳囊孢属为雪山杜鹃的特有属，鳞翅虫草属为雪层杜鹃特有属；在茎部组织中，放射毛霉属为雪层杜鹃特有属，链格孢属、略氏端隔孢壳菌属、毛霉属和假散囊菌属为雪山杜鹃的特有属；在叶部组织中，放射毛霉属、链格孢属、略氏端隔孢壳菌属、绿僵菌属和木霉属为雪层杜鹃特有属，枝孢霉属、亚隔孢壳属为雪山杜鹃的特有属；在花组织中，毛霉属为雪层杜鹃特有属，毛壳属为雪山杜鹃的特有属。

从表3可以看出，杜鹃属植物不同组织部位的定殖率分别为茎92.71%、根91.15%、花90.97%、叶90.63%，分离率分别为茎48.96%、根48.44%、花47.92%、叶41.67%。

2.3杜鹃属植物内生真菌的多样性分析4种杜鹃属植物多样性分析结果（表4）显示，Shannon多樣性指数（H′）从大到小依次为雪山杜鹃>雪层杜鹃>髯花杜鹃>米林杜鹃，多样性最高的是雪山杜鹃，最低的是米林杜鹃。辛普森指数（D）从大到小依次为雪山杜鹃>雪层杜鹃>髯花杜鹃>米林杜鹃。将多样性数据进行显著性差异分析，P值为0.40，说明4种杜鹃属植物内生真菌无显著差异。

2.4杜鹃属植物不同组织内生真菌的多样性分析从杜鹃属植物不同组织部位（根、茎、叶、花）的多样性指数（表5）可以看出，Shannon多样性指数（H′）从大到小依次为根>茎>叶>花，多样性最高的是根，最低的是花。辛普森指数（D）从大到小依次为根>茎=花>叶。将多样性数据进行显著性差异分析，P值为0.39，说明4种杜鹃属植物不同组织内生真菌无显著差异。

3讨论

该研究对西藏4种杜鹃属植物720个组织块进行分离得到336株内生真菌，鉴定为21属55种。根、茎、叶和花组织中优势属都有曲霉属、白僵菌属和青霉属。其中曲霉属和青霉属为许多药用的草本植物和木本植物的优势种［9］。有研究报道，青霉属、曲霉属、木霉属、链格孢属等在亮毛杜鹃（R.microphyton Franch）根际内生真菌中存在，其中青霉属是优势属［24］；青霉属、木霉属在杜鹃种（R.simsii）根部内生真菌中发现，且为优势属［25］。子囊菌和木霉属在马缨杜鹃（Rhododendron delavayi）内生真菌中被报道，其中子囊菌为优势菌群［26］。曲霉属、拟隐壳孢属、镰刀菌属和壳多胞菌属在西藏米拉山雪层杜鹃的内生真菌中被分离发现［16］。该研究发现4种杜鹃属植物内生真菌共有类型为曲霉属、青霉属、链格孢属、白僵菌属。其中白僵菌属在其他杜鹃属植物内生真菌鉴定中鲜见报道。

于洪佳等［27］研究报道青霉属和曲霉属具有抗菌、抗癌、抗肿瘤、抗氧化、杀虫、免疫调节等功效。曲霉属和青霉属都有生物碱类、聚酮类、萜类、肽类、固醇类和脑苷脂类等化合物［28］。从枝孢霉属的次级代谢产物中分离出甾醇、倍半萜类、生物碱类、二酮哌嗪、芳香酸等化合物［29］。篮状菌属的次级代谢产物有萜类、生物碱类、聚酮类、聚酯类、醌类和甾体类，具有抗菌、抗病毒、抗真菌、抗肿瘤活性、生物防治和产生酶活等作用，在食品、环境、农业和医药等方面发挥了重要作用［30］。毛壳属真菌代谢产物的主要类型为细胞松弛素类和唑啉酮两大类，包含细胞松弛素、唑啉酮类、二酮哌嗪类、色原酮、蒽醌等结构类型，表现出抗微生物、抗氧化、免疫抑制等生物活性，具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等作用［31］。

综上所述，该研究对西藏地区不同种杜鹃属植物的不同组织内生真菌进行分离鉴定，发现种间真菌多样性差异不明显，同种植物不同部位内生真菌差异不明显，说明4种内生真菌组成相似，且优势属都有曲霉属、白僵菌属和青霉属。该研究结果为下一步内生真菌代谢产物研究提供基础。

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