白术叶片DNA提取方法的优化

蒋小刚　王华　周武先　由金文　张美德

摘要［目的］优化白术叶片DNA提取方法，提取高质量DNA，用于分子生物学研究。［方法］以白术叶片为材料，比较常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法、试剂盒法提取DNA的效果，并对改良CTAB法中的裂解温度、裂解时间、核分离液解离次数进行优化，用琼脂糖凝胶电泳和微量核酸测定仪检测DNA的浓度和纯度。最后通过ISSR-PCR验证优化的改良CTAB法提取DNA的效果。［结果］4种方法中，改良CTAB法提取白术叶片DNA效果最好。针对叶片的改良CTAB法的优化条件为裂解温度65 ℃、裂解时间20 min、解离次数2 次；ISSR-PCR验证结果表明扩增条带清晰稳定，无拖尾。［结论］优化后的改良CTAB法提取白术叶片DNA质量高，可用于白术种质资源遗传多样性分析。

关键词白术；DNA；提取方法；改良CTAB法

中图分类号R284文献标识码A

文章编号0517-6611（2023）11-0128-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.032开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of DNA Extraction Method for Atractylodes macrocephala Leaves

JIANG Xiao-gang，WANG Hua，ZHOU Wu-xian et al（Key Laboratory of Biology and Cultivation of Herb Medicine，Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Chinese Herbal Medicines，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Enshi，Hubei 445000）

Abstract［Objective］To optimize the DNA extraction method of Atractylodes macrocephala leaves and extract high-quality DNA for molecular biology research.［Method］A.macrocephala leaves were used as material，the DNA extraction effects of four methods （conventional CTAB，modified CTAB，SDS and Kit method） were compared，and the cracking temperature，cracking time and times of nuclear separation liquid extraction in the modified CTAB method were optimized，the concentration and purity of the extracted DNA were detected by agarose gel electrophoresis and spectrophotometer.Finally，the effects of DNA extracted by the modified CTAB method after optimization was verified by ISSR analysis.［Result］Among the four extraction methods，the modified CTAB method had the best extraction effects of DNA.The optimal extraction conditions of the improved CTAB method of leaves were as follows：cracking temperature was 65 ℃，cracking time was twenty minutes，dissociation times was twice.The ISSR-PCR validation results showed that the amplified bands were clear and stable，without any trailing.［Conclusion］The optimized CTAB method was effective in extracting DNA of A.macrocephala leaves.And it could be used for genetic diversity analysis of A.macrocephala.

Key wordsAtractylodes macrocephala;DNA;Extraction method;Modified CTAB method

白術 （Atractylodes macrocephala Koidz.） 属于菊科苍术属多年生草本植物，以根茎入药，具有健脾益气、燥湿利水、止汗安胎的功效［1］。基于分子生物学技术开展药用植物种质资源评价工作尤为重要，而高效提取DNA是更好进行分子生物学研究的前提，此外，大多数药用植物组织中富含多糖、多酚等物质，常规方法提取的DNA较难满足PCR、基因克隆、测序等分子生物学需求，因此很多学者开展了药用植物基因组DNA提取方法的优化研究，以建立高效提取高质量DNA的方法。

邵亚林等［2］以杏黄兜兰叶片为材料，比较了CTAB法、改良CTAB法、高盐低pH法和 SDS法提取DNA的效果，结果表明，改良CTAB法优于其他方法，但提取的DNA存在一定蛋白质污染，且未进行PCR扩增反应验证。郑斯斯等［3］以壳斗科植物叶片为材料，比较不同方法提取DNA效果并对最佳方法进行优化，结果表明，优化后的改良CTAB法提取DNA浓度和纯度高，适用于PCR扩增和酶切反应。针对不同药用植物或药用植物的不同组织，需建立相适应的DNA提取方法，而有关白术不同组织基因组DNA提取方法的研究较少，多采用CTAB法。如黄恒等［4］对改良CTAB法和SDS法提取白术叶片基因组DNA的效果进行比较，结果表明，改良CTAB法提取白术叶片DNA质量高于SDS法，可作为模板用于分子标记研究，但提取DNA用时较长；王志安等［5］采用CTAB法提取白术幼嫩叶片的基因组DNA，并构建了DNA指纹图谱，结果表明，提取的白术基因组DNA适用于AFLP指纹图谱分析，但存在一定量蛋白质、多酚等物质污染；曹亮等［6］采用改良CTAB法提取白术、苍术的干种子DNA，并通过多重PCR技术对白术、苍术混杂种子进行鉴别，结果表明，提取的DNA模板满足于多重PCR反应，但提取DNA所需时间较长。也有研究采用试剂盒法提取白术DNA，如余亚东等［7］采用试剂盒法提取白术、苍术根茎DNA，并建立了鉴别白术、苍术等的DNA条形码技术，结果表明，提取的DNA模板适用于PCR扩增及进一步的种质鉴定研究，但DNA提取量较低，且成本高。以上研究，以白术为研究对象，主要采用改良CTAB法提取基因组DNA，基本能满足分子生物学的研究，但存在用时较长、DNA质量偏低的问题，虽然试剂盒法能有效去除DNA中的多糖多酚物质，但成本较高、提取DNA量较少，同时伴随一定降解［3］。该研究以白术幼嫩叶片为材料，比较常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法、试剂盒法提取DNA的效果，并对改良CTAB法中的裂解温度、裂解时间、解离次数等因素进行优化，然后用琼脂糖凝胶电泳和超微量核酸检测仪检测DNA浓度和纯度，最后通过ISSR-PCR验证优化的改良CTAB法提取DNA的效果，以便用于白术遗传多样性分析、种质鉴定等研究。

1材料与方法

1.1试验材料供试材料包括一年生白术幼嫩叶片。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）、三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）、核糖核酸A（RNaseA）、氯仿、异戊醇、异丙醇、DL2000 DNA Marker、琼脂糖，均购自武汉中恩科技有限公司。主要仪器设备包括离心机（SIGMA 3K15）、电泳仪（DYCP-31DN）、超微量核酸蛋白测定仪（Thermo NANODROP ONE）、PCR仪（DYY-12）。

1.2试验方法

1.2.1不同DNA提取方法。采用常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法和试剂盒法提取白术叶片基因组DNA。

1.2.1.1常规CTAB法。参照马辉等［8］的方法并进行改进，具体步骤如下：取0.2 g白术幼嫩叶片于预冷研钵中，液氮中迅速研磨后转入2 mL离心管中，加入800 μL CTAB核裂解液（100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;50 mmol/L EDTA，pH 8.0;1.4 mol/L NaCl;2％CTAB;2％PVP;2％β-巯基乙醇）和20 mg/mL蛋白酶K 5 μL，65 ℃水浴40 min（期间每隔10 min轻轻摇动离心管一次），然后加入等体积的氯仿-异戊醇（24∶1），混匀30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液至2 mL离心管中，然后加入等体积的预冷异丙醇，混匀，12 000 r/min离心15 min，弃上清。用95％乙醇清洗沉淀2次，室温风干，加50 μL TE缓冲液溶解沉淀，加5 μL RNaseA （10 mg/mL）混匀，室温放置30 min，-20 ℃保存备用。

1.2.1.2改良CTAB法。取0.2 g白术幼嫩叶片于预冷研钵中，液氮中迅速研磨后转入2 mL离心管中，加入1.5 mL 4 ℃预冷的核分离液混匀，12 000 r/min离心10 min，弃上清收集沉淀，将上述收集沉淀按常规CTAB法提取。

1.2.1.3SDS法。参照王景雪等［9］的方法稍作改动，具体步骤如下：①取0.2 g白术幼嫩叶片于预冷研钵中，液氮中迅速研磨后转入2 mL离心管中，加入800 μL溶液I （500 mmol/L NaCl;50 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0;50 mmol/L EDTA;2％PVP;2％β-巯基乙醇），置于室温数分钟至解冻；②加入280 μL 10％SDS，轻轻混匀，45～65 ℃水浴20～40 min（期间每隔10 min轻轻摇动离心管一次）；③取出后立即置于冰上，并加入120 μL 5 mol/L 醋酸钾于冰上反应30 min，在12 000 r/min、4 ℃下离心20 min；④取上清液，加入等体积异丙醇，轻轻混匀后，-20 ℃放置1 h，于4 ℃下离心20 min；⑤弃上清液，用500 μL TE缓冲液溶解沉淀，向其中加入2/3体积的氯仿-异戊醇（24∶1）混匀后，4 ℃、12 000 r/min离心5 min；⑥取上清液，向其中加入等体积的异丙醇和1/10体积的3 mol/L NaCl，于-20 ℃放置1 h，于4 ℃、12 000 r/min离心20 min；⑦弃上清，用95％乙醇洗涤沉淀1次，室温风干；⑧加50 μL TE缓冲液溶解沉淀，加5 μL RNaseA （10 mg/mL）混匀，室温放置30 min，然后置于-20 ℃保存备用。

1.2.1.4试剂盒法。采用天根生化科技（北京）有限公司生产的新型植物基因组提取试剂盒（DP320-02）。具体步骤如下：①取植物新鲜组织100 mg或干重组织20 mg加入液氮充分碾磨；②加入400 μL缓冲液LP1和6 μL RNaseA（10 mg/mL）旋涡振荡1 min，室温放置10 min；③加入130 μL缓冲液LP2，充分混匀旋涡振荡1 min，然后12 000 r/min离心5 min，将上清移至新的离心管中；④加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15 s，此时可能会出现絮状沉淀；⑤将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，然后12 000 r/min离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑥向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），然后12 000 r/min离心30 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中；⑦重复操作步骤⑥；⑧12 000 r/min离心2 min，倒掉废液，将吸附柱CB3室温放置2 min彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；⑨将吸附柱CB3转入新的1.5 mL离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50～200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。

1.2.2改良CTAB法提取白术叶片DNA的优化试验。

1.2.2.1裂解温度优化。采用改良CTAB法提取白术叶片DNA，裂解温度设为45、55、65 ℃，其他条件不变，详见“1.2.1.2”。

1.2.2.2裂解时间优化。采用改良CTAB法提取白术叶片DNA，裂解时间设为20、30、40 min，其他条件不变，详见“1.2.1.2”。

1.2.2.3核分离液解离次数优化。采用改良CTAB法提取白术叶片DNA，解离次数设为0、1、2次，其他条件不变，详见“1.2.1.2”。

1.2.3DNA提取浓度和纯度检测。

1.2.3.1超微量核酸蛋白测定仪检测。取2 μL DNA提取液，用超微量核酸测定仪检测DNA浓度（ng/μL）和纯度。DNA提取量（mg/g）＝DNA浓度×50×10-6/组织鲜重或干重；DNA质量判定标准：当OD₂₆₀/OD₂₈₀=1.80时，纯DNA；当OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.80～2.00时，属于正常范围；当OD₂₆₀/OD₂₈₀＞2.00时，说明有大量RNA污染；当OD₂₆₀/OD₂₈₀＜1.80时，说明有蛋白质、酚类等污染。

1.2.3.2琼脂糖凝胶电泳检测。用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA质量，并用凝胶成像系统检测拍照。

1.2.3.3改良CTAB法优化后的效果验证。采用优化的改良CTAB法提取白术叶片基因组DNA，并以此为模板，用中药材条形码引物ITS2（F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′）和ISSR引物UBC845（5′-CTCTCTCTCTCTCTCTRG-3′）进行扩增。PCR反应体系：20 μL反应体系中，2×Taq Master Mix 10 μL，模板DNA 1 μL，引物2 μL，ddH2O 7 μL。PCR程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性0.50 min，56 ℃退火0.75 min，72 ℃延伸1.0 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

2结果与分析

2.1不同方法提取白术叶片DNA的效果比较用常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法和试剂盒法提取白术叶片基因组DNA，结果如表1所示。4种方法中，改良CTAB法的DNA提取量最高，为0.015 1 mg/g；试剂盒法的DNA提取量仅次于改良CTAB法；SDS法提取量最低，仅为0.005 0 mg/g。除试剂盒法外的其他3种方法叶片DNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀在正常范围（1.80～2.00）。综上所述，改良CTAB法为提取白术叶片DNA的最优方法。

2.2裂解温度对改良CTAB法提取白术叶片DNA效果的影响由表2可知，裂解温度在45～55 ℃，随着裂解温度升高，改良CTAB法的白术叶片DNA提取量呈现升高的趋势。裂解温度为65 ℃时， DNA提取量最高，达到了0.027 7 mg/g。不同裂解温度下，白术叶片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.92～1.96，表明不同裂解温度对改良CTAB法DNA提取纯度无明显影响。综上可知，改良CTAB法提取白术叶片DNA的最适裂解温度为65 ℃。

2.3裂解时间对改良CTAB法提取白术叶片DNA效果的影响由表3可知，裂解时间在20～40 min，随着裂解时间增加，白术叶片DNA提取量呈现不断下降的趋势，裂解时间为20 min时，叶片DNA提取量最高（0.024 0 mg/g）。裂解时间为20、30 min时，叶片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀为1.95～1.97，DNA较为干净，无明显蛋白质、RNA污染，而裂解时间为40 min时，叶片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀仅为1.63，DNA含有少量杂质，存在一定蛋白质、酚类物质污染。综上所述，改良CTAB法提取白术叶片DNA的最佳裂解时间为20 min。

2.4核分离液解离次数对改良CTAB法提取白术叶片DNA效果的影响由表4可知，随着核分离液解离次数增加，叶片DNA提取量呈现逐渐增加的趋势，即叶片DNA提取量最大时的解离次数为2次。不同解离次数下，叶片DNA OD₂₆₀/OD₂₈₀在正常范围（1.80～2.00）。综上所述，改良CTAB法提取白术叶片DNA的最佳解离次数为2次。

2.5优化的改良CTAB法提取DNA的效果验证用优化的改良CTAB法提取白术叶片基因组DNA，以此为模板，用中药材条形码引物ITS2和引物UBC845進行扩增，验证提取DNA的效果，结果如图1所示，扩增条带清晰稳定、无杂带，优化的改良CTAB法提取的白术叶片基因组DNA可用于后续白术遗传多样性分析、种质鉴定等研究。

3讨论与结论

目前的研究多采用改良CTAB法的试剂盒法提取白术叶片、根茎、种子的基因组DNA［5-7］，且仅有黄恒等［4］以白术叶片为材料比较了改良CTAB法、SDS法提取DNA效果。该研究以白术叶片为材料，比较了常规CTAB法、改良CTAB法、SDS法、试剂盒法提取DNA效果，发现相比常规CTAB法、SDS法，改良CTAB法提取叶片DNA质量较高，与黄恒等［4］研究认为改良CTAB法提取白术叶片效果优于SDS法的结论一致。该研究中，改良CTAB法的DNA提取量略高于试剂盒法，且试剂盒法提取DNA成本较高。综合来看，改良CTAB法为提取白术叶片DNA的最佳方法。目前，改良CTAB法已广泛应用于提取油菜等作物［10-13］的基因组DNA，提取效果较好。

针对特定的分子水平的研究，往往需要提取植物特定组织的DNA，而不同组织或细胞结构、成分的差异导致同一方法提取不同组织DNA效果差异较大，因此需要优化适应于植物不同组织的DNA提取方法［14］。水浴裂解时间对于DNA提取效果非常重要，裂解时间过短，DNA不能释放完全，导致提取率较低，而裂解时间过长，DNA会发生降解［15］。该研究通过分析改良CTAB法中裂解时间对白术叶片DNA提取效果的影响，发现裂解时间为20 min时，叶片DNA的提取量最高，低于以白术叶片、种子为材料的研究采用的裂解时间［5，7，9］，表明该研究对白术改良CTAB法的裂解时间的优化效果较好。

细胞质中多酚类等次生代谢物质会影响DNA提取量，PVP 能有效去除DNA中的多酚物质；β-巯基乙醇能有效防止酚氧化成醌类物质，避免褐变，使酚易被去除；因此通过在核分离液中加入PVP和β-巯基乙醇，经过核分离液除去多酚类物质，可有效提高DNA的提取量［8，16-17］。该研究通过分析改良CTAB法中核分离液解离次数对白术叶片DNA提取效果的影响，发现白术叶片解离2 次，DNA提取量最高。

优化后的改良CTAB法提取白术叶片DNA效果好，可用于白术遗传多样性分析、种质资源鉴定、分子辅助育种等。但该研究仅对改良CTAB法提取白术叶片DNA的主要影响因素进行优化，针对特定分子试验需求，还需做进一步改进，以更好开展后续白术分子生物学研究，为白术遗传多样性分析、种质鉴定等奠定基础。

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