结直肠癌中THBS2、Survivin的表达及临床意义

海尔汗,肖正杰,田庆刚

(1.包头医学院,内蒙古包头 014040;2.暨南大学附属第五医院;3.包头市第四医院)

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,近年认为其发病同西方式生活方式、饮食结构、体力劳动减少及社会经济进步程度密切相关[1]。科研人员对结直肠癌的发病机制、侵犯和转移途径以及治疗手段进行深入研究,致力于改善结直肠癌患者的生存期和预后。结直肠癌的发生是受到多因素影响的复杂过程,可由机体内癌基因激活、抑癌基因突变失活等原因导致,机制仍不明确。血小板反应蛋白2(thrombospondin 2,THBS2)是基质细胞钙结合糖蛋白家族成员,参与血管生成的抑制,也可通过结合不同的受体,参与细胞运动、细胞骨架构建及调节细胞凋亡、增殖及黏附等[2-3]。THBS2可介导细胞外基质组装、细胞间基质相互作用,参与基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)降解细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过程,抑制血管生成。MMP-2与MMP-9为MMPs家族中的Ⅳ型胶原酶类型,参与破坏肿瘤ECM的组织学屏障,继而参与肿瘤的侵袭转移[4]。生存素(Survivin)是细胞凋亡抑制剂(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的成员之一,是一类细胞周期调节因子,在细胞周期的G2/M期发挥抑制凋亡作用,继而保护正常有丝分裂的进行,而在Survivin被定位于中心体内的微管上作用于一种终末剪切酶caspase-3时,表现抑制细胞凋亡过程,继而出现异常的增生和分裂[5]。Survivin绝少在终末分化的组织中表达,在肿瘤细胞中参与调控肿瘤细胞的分裂和死亡,与化疗耐药性和肿瘤侵袭均具有相关性[6]。近期美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)更新了第8版结直肠癌分期[7],具有更加完善的临床肿瘤学预后和预测评价系统。目前,结直肠癌治疗趋于个体化,手术、放化疗及新辅助治疗水平提升,预后和早期治疗息息相关。本研究通过运用免疫组化方法检测60例患者结直肠癌组织中THBS2及Survivin的表达情况,探究THBS2与Survivin在结直肠癌组织中表达与各病理参数及临床指标的关系,探究二者在结直肠癌中表达相关性及二者是否对生存期有影响,并探究二者表达情况与AJCC(第8版)结直肠癌分期的关系。

1 对象与方法

1.1对象 收集包头医学院第四附属医院2014年7月至2017年7月期间手术治疗并有完整病历资料的结直肠癌患者石蜡组织标本60例作为结直肠癌组,其中女性26名、男性34名,年龄≤65岁26例、>65岁34例;随机选取上述石蜡包埋保存组织标本的癌旁结直肠组织20例为结直肠组。纳入标准:术前均未接受过放化疗;临床病理数据完整;术后病理活检明确诊断为结直肠癌(非转移癌)。排除标准:结直肠癌合并其他恶性肿瘤;随访资料不全;二次或多次手术患者;具有明确结直肠癌家族遗传史患者。本研究经包头医学院第四附属医院伦理委员会审核批准,取用标本及随访均经过受试者或家属知情同意。

1.2方法 将由病理科保存的10 %多聚甲醛固定并石蜡包埋制成的组织蜡块,每个蜡块按4 μm至少切片5张。选择组织部位合理的切片65 ℃烘烤1 h,迅速置于二甲苯10 min后依次经无水乙醇、95 %乙醇、75 %乙醇及蒸馏水各5 min完成脱蜡。3 % H2O2室温孵育10 min灭活阻断内源性过氧化物酶,蒸馏水冲洗5 min,磷酸缓冲盐溶液(PBS)浸洗5 min。将切片浸入乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修复液(pH 6.0)中,置于微波炉中加热沸腾后停止,持续20 min,室温冷却30 min,PBS浸洗2次,5 min/次。两组分别滴加1∶100 THBS2兔抗人多克隆抗体及1∶100 Survivin兔抗人多克隆抗体,4 ℃冰箱孵育过夜,PBS浸洗3次,5 min/次。分别滴加通用二抗,37 ℃温箱孵育30 min。避光滴加DAB显色液,10 min后蒸馏水清洗。苏木素复染1 min后蒸馏水清洗。1 %盐酸酒精速洗分化。蒸馏水清洗10 min,返蓝。75 %乙醇5 min、95 %乙醇5 min、无水乙醇各5 min,脱水2次。二甲苯透明后,中性树胶封片。

1.3结果判定 随机选取5个高倍镜视野,以染色深浅程度与阳性细胞所占百分比联合判定。染色强度:无色计0分,淡黄色计1分,棕黄色计2分,黄褐色为3分;按阳性细胞所占的百分比计分:≤5 %为0分;>5 %且≤25 %为1分,>25 %且≤50 %为2分,>50 %为3分。分别将染色强度及阳性细胞百分比计算乘积,0～3分记录为阴性,4～9分记录为阳性。以上结果判读由2名高年资病理科医师双盲法独立判读,并通过判读结果取平均值。

1.4统计学方法 数据分析和处理采用SPSS 26.0软件,计数资料用频数或率(%)表示,THBS2与Survivin在结直肠癌中表达情况与结肠癌各因素之间差异性研究采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义,个别样本组频数为140,采用校正χ2检验,对于多组组中具有较小频数或个别样本频数为0的数据,采用Fisher-Freeman-Halton法。应用GraphPad Prism软件绘制生存期曲线。THBS2和Survivin在结直肠癌组织中表达相关性采用Spearman相关性分析。

2 结果

2.1THBS2与Survivin在癌旁组织和结直肠组织中表达情况 THBS2在20例癌旁组织中阳性表达率为10.0 %(2/20),60例结直肠癌中阳性表达48例,阳性表达率为80.0 %(48/60),两组差异具有统计学意义(χ2=31.360,P<0.05);Survivin在20例癌旁组织中阳性表达率为5.0 %(1/20),在60例结直肠癌组织中阳性表达率为83.3 %(50/60),两组差异具有统计学意义(χ2=39.829,P<0.05)。免疫组化结果见图1。

图1 结直肠癌免疫组化染色图片(×400)注:A:THBS2结直肠癌阳性,B:THBS2结直肠癌阴性,C:Survivin结直肠癌阳性,D:Survivin结直肠癌阴性

2.2THBS2及Survivin在结直肠癌中表达情况同各病理参数及美国癌症联合委员会AJCC第8版 结直肠癌分期的关系女性26例、男性34例;≤65岁26例、>65岁34例;管状腺癌50例、黏液腺癌10例;有淋巴结转移46例、无淋巴结转移14例;有肝转移4例、无肝转移56例;乙状结肠19例、横结肠3例、升结肠26例、降结肠12例;结直肠癌分化程度为中分化18例、低分化23例、高分化19例;肿瘤大小直径≥5 cm 26例、<5 cm 34例;AJCC(第8版)分期1期1例、2A期8例、2B期4例、3A期16例、3B期20例、3C期7例、4A期4例。THBS2及Survivin在结直肠癌中表达情况见表1,结果显示,在结直肠癌中THBS2及Survivin的表达与不同性别、年龄、病理分型、肿瘤大小、肿瘤部位及有无肝转移等不相关(P>0.05),与是否淋巴转移、肿瘤分化程度及第8版AJCC分期具有相关性(P<0.05)。

表1 THBS2和Survivin在结直肠癌组织中的表达情况

2.3相关性分析 在结直肠癌组织中THBS2及Survivin表达Spearman相关系数r=0.447(P<0.05),提示二者在结直肠癌中表达呈正相关。见表2。

表2 THBS2与Survivin蛋白在结直肠癌中表达的相关性

2.4生存期 对2014年7月至2017年7月期间收治的手术病例30例患者进行随访,截至2021年7月时随访存活15例、死亡15例,其中最长存活期为72个月,根据随访月数及是否生存绘制生存期曲线,见图2。生存期曲线提示THBS2阳性患者较THBS2阴性患者的生存曲线下降幅度大而快,提示阳性表达患者的生存时间短,预后差。

图2 结直肠癌组织THBS2、Survivin表达情况的生存期曲线

3 讨论

结直肠癌是全球面临的重大公共卫生问题,长期严重威胁人类健康,近年其发病率和死亡率仍在不断攀升。我国当前面临的防治形势非常严峻,目前城市居民结肠癌发病率已接近西方发达国家[8]。结直肠癌的发生是由多基因调控、分阶段演化的复杂过程,已被广泛认可的是染色体不稳定途径(CIN途径),有60 %的结直肠癌患者经这一途径发生。APC抑癌基因变异在腺瘤-肿瘤形式发生演变过程发挥作用。赵婧等[9]研究发现,APC基因和Survivin基因异常表达于结直肠癌家族史及大肠多发性腺瘤家族史的患者中,二者在正常增生的结直肠组织中表达情况较少。在正常增生细胞中与异型增生的恶性肿瘤细胞中Survivin的表达有较明显的差异,这种差异在肿瘤的异质性中也得到了认证。Survivin在良性、恶性肿瘤的表达也存在差异性,低度异型增生腺瘤、中度、高度甚至重度异型增生腺瘤及结直肠癌中Survivin表达有较明显的上调[10]。良性肿瘤与恶性肿瘤的主要区别之一是肿瘤细胞的失克隆性和失调控性的差异,故Survivin在不同组织和不同肿瘤发展阶段存在差异性表达,证明其在各器官肿瘤的发生发展演变过程中发挥着重要作用。在恶性肿瘤中,Survivin可抑制凋亡终末效应酶活性,也可结合周期蛋白激酶(Cyclin-dependent kinase 4,CDK4)阻断凋亡信号转导通路[11]。THBS2是一种细胞膜表面钙结合糖蛋白,在细胞凋亡、创口愈合、血管生成及炎症反应中均起到关键作用,在其血小板反应蛋白结构域(Ⅰ型结构域)已被确认具有抗血管生成作用[12],THBS2与小分子核糖核酸结合导致与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)之间的结合力下调[13],表现为促进肿瘤转移和侵袭的作用。THBS2在不同组织及器官的肿瘤发生和转移过程中发挥作用。THBS2高表达与胰腺癌、肺癌、原发性肝癌的发生发展及预后相关[14-16]。

Survivin在胃肠道肿瘤中被证实可上调VEGF[17],从而增强肿瘤血管及淋巴管的生成,而THBS2也有间接通过结合受体调控VEGF继而促进淋巴转移的作用。二者可能存在相互促进协同作用,但相关研究不足。本研究中THBS2与Survivin在有淋巴结转移患者中阳性表达率更高,结果提示Survivin高表达的结直肠癌患者中,更易于发生淋巴结转移,这与陈洁等[18]的结果一致。说明THBS2与Survivin在结直肠癌的转移过程中起到正性作用。THBS2与Survivin在低分化组的阳性表达明显,相比高、中分化组表达率更高,与陈建发等[19]结果一致,提示THBS2与Survivin参与结直肠癌的分化过程。Survivin在肿瘤的不同阶段存在差异性表达,分化不完全的肿瘤组织中Survivin表达明显,提示肿瘤发生发展过程中存在错误的凋亡抑制与异常激活的血管生成。本研究中结直肠癌的AJCC(第8版)分期THBS2与Survivin阳性表达结果显示,随分期的不断增加二者阳性表达率也在逐渐提高,提示阳性表达的结直肠癌患者可能具有较差的生存及预后。THBS2与Survivin可成为AJCC的潜在评测因素。本研究中,Survivin和THBS2在结肠癌组织中共同表达44例,共同阴性表达及各自单独阳性表达均为6例,二者表达情况呈正相关,提示二者在结直肠癌的发生、演变、发展的过程有促进作用,但二者共同表达对于患者生存期无明显影响,二者相关性及具体作用机制不详。

综上所述,检测THBS2和Survivin在结肠癌组织中的表达,有助于了解结直肠癌的发生、演变、转移;二者可能存在直接或间接的调控关系,需要进一步实验证实。根据THBS2与Survivin在结直肠癌中表达特异性与相关性以及与AJCC结直肠癌分期的关系,二者可能为结直肠癌的预后评估提供新的思路和切点。