减重手术调控胃饥饿素对肥胖大鼠摄食量和体质量的影响*

张泽宇,李瑞斌,王 玮,万智恒

(1.内蒙古科技大学包头医学院2019级研究生,内蒙古包头 014040;2.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院)

肥胖定义为异常脂肪堆积,被认为是能够严重影响人类健康的慢性疾病。世界卫生组织预测21世纪中叶,世界人口的2/3即近20亿人将发展为超重,另外1/3人口发展为肥胖[1]。传统观念认为肥胖症可通过限制饮食、适当规律的运动等方式得到控制。然而这些干预措施的效果与患者个人的习惯相关,若患者难以坚持则易造成反弹;内科治疗虽然能有效降低体质量并且短期内取得一定的效果,但减重的效果难以得到保障。减重手术起源于20世纪中叶,在60年间不断发展进步,目前成为了病态肥胖和肥胖型2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝炎最有效的治疗方法之一[2]。Roux-en-Y胃旁路术(RYGB)和立式袖状胃切除术(VSG)是减重手术中最常见的两种术式,已有相关临床研究表明,接受减重手术的患者在进行减重术后的2年、6年和12年分别实现了35 %、28 %和26.9 %的总体质量减轻,其中2型糖尿病患者在2年、6年和12年的体质量减轻程度分别为75 %、62 %和51 %[3]。虽然减重手术效果较好,但其降低摄食量和体质量的分子机制仍有待探索。

胃饥饿素(Ghrelin)是一个28个氨基酸肽类激素,主要在胃组织中表达,可通过血-脑屏障进入下丘脑,具有促进摄食的作用。Ghrelin对食欲和体质量的刺激作用通过下丘脑弓状核和腹内侧核中的生长因子促分泌素受体介导产生。mTOR可通过自噬调节能量代谢。研究表明,mTOR信号通路表达失调可与癌症、肥胖、糖尿病和神经退行性疾病等多种疾病相关[4]。mTOR信号通路活性与病理性肥胖相关,且相关研究发现mTOR/p70s6k基因敲除的小鼠免受饮食诱导肥胖的影响[5]。近年研究发现,食欲控制因子CB1受体和Ghrlein在胃底内分泌细胞共表达。mTOR通路可协调胃大麻素系统和Ghrelin的相互作用,CB1受体阻断剂可减少食物摄入,增加胃中mTOR/p70S6k的活性,使Ghrelin的水平降低[6]。大量文献表明,进餐后Ghrelin高表达可以引起食欲下降,且减重术后Ghrelin基因发生变化,体质量成功下降。深入研究Ghrelin与肥胖之间的相关性,发现减重手术对其调控机制,这在对肥胖的治疗中至关重要。本实验旨在观察减重手术对肥胖大鼠摄食量、体质量的影响,以及是否与术后Ghreiln、mTOR/p70s6k通路变化有关,为肥胖的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1.1动物及分组 5周龄、体质量160～180 g的雄性SPF级SD大鼠90只购自北京斯贝福。随机分成普通饲料组(15只)与高脂饲料组(75只)。普通饲料组采用普通维持饲料饲养作对照组,高脂饲料组采用45 %高脂饲料饲养[7],两组饲料均足量,保证自由摄食水。记录构建模型期间大鼠的摄食量及体质量变化,记录每天摄食量,每周称量1次体质量。经过5周高脂饲料喂养,高脂饲料组中体质量高于普通饲料组20 %以上的大鼠视为肥胖模型构建成功。将构建成功的肥胖大鼠随机分成肥胖模型组、假手术组、减重手术组,7只/组。术后1周,假手术组与手术组大鼠由营养液(安素)过渡到摄入同先前的高脂饲料后,自由摄食水。

1.1.2主要试剂与仪器 Ghrelin(PA5-18409)、mTOR(AHO1232p70)、p70s6k(A300-510A-T)、BCA蛋白定量试剂盒(23227)购于美国Thermo Fisher公司;p-mTOR(59.Ser 2448):(sc-293133)购于美国Santa Cruz公司;p-p70s6k(Ser427)(12524)购于美国SAB公司;β-actin(bs-0061R)购于北京bioss公司;二抗IgG山羊抗兔(P03S02)、山羊抗小鼠(P03S01)购于北京金普莱公司;RIPA裂解液(BL504A)。垂直电泳槽、蛋白电泳仪购自美国Bio-Rad公司,化学发光仪天能5800购自上海天能科技有限公司。

1.2方法

1.2.1手术 造模成功的手术组肥胖大鼠术前禁食水12 h,采用10 %水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后,备皮逐层开腹后暴露出胃组织,找到肝胃韧带、脾胃韧带并离断后,沿胃大弯一侧分批离断结扎网膜血管弓及胃短血管,分别于胃大弯幽门、his角上下两点,沿胃小弯走形各夹闭一把无损伤血管钳,沿血管钳离断并移除约70 %～80 %大弯侧胃组织,包含全部胃底。切缘消毒后用无菌缝线(5-0)间断缝合切缘,彻底止血。将残留胃组织回置原位。逐层关闭腹膜、肌肉、皮肤,完成袖状胃手术操作。假手术组与减重手术组进行相同的围手术期处理,逐层开腹后进行腹腔探查,从食管下端开始检查到结肠的全部肠段,离断胃周血管并暴露小肠,以湿纱布覆盖,假手术组时间、关腹步骤同手术组,切口长度与手术组大致相近。

1.2.2血脂测定 术后4周,大鼠腹腔注射10 %水合氯醛溶液麻醉后,将大鼠仰卧固定于手术台上,备皮消毒后沿腹正中线开腹,用一次性采血针和真空管于腹主动脉取血。离心取血清置入全自动生化分析仪检测三酰甘油(TG)和总胆固醇(TC)含量。

1.2.3样品采集 术后4周,将大鼠麻醉处死后取胃组织,并储存于-80 ℃。

1.2.4Western-blot 在胃组织中加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂以及磷酸酶抑制剂,超声裂解提取总蛋白,BCA试剂盒对蛋白浓度进行定量。采用20 μg上样量,用8 %聚丙烯酰胺凝胶电泳,恒压80 V随后400 mA转膜过夜,将蛋白转移至PVDF膜上。用5 %脱脂牛奶室温封闭1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,然后分别与β-actin、Ghrelin、mTOR、p70s6k、p-mTOR、p-p70s6k(1∶2 000)一抗4 ℃孵育过夜,TBST洗膜3次,10 min/次,然后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗(1∶5 000)常温孵育1 h,TBST洗膜3次,10 min/次,ECL发光。以β-actin作为内源性对照。

2 结果

2.1减重术后体质量和摄食量的变化 测量记录术后1-4周各组大鼠摄食量及体质量变化,结果可见,与肥胖模型组和假手术组大鼠相比,手术组肥胖大鼠减重术后第2周起体质量下降,第4周降至最低,摄食量也有显著降低。见表1。

表1 术后摄食量和体质量的变化

2.2减重术后的血脂结果 假手术组与肥胖模型组大鼠血清三酰甘油和总胆固醇含量高于对照组和减重手术组(P<0.05),见图1。

图1 血清三酰甘油和总胆固醇含量注:control代表对照组,sham代表假手术组,model代表肥胖模型组,operation代表减重手术组。*P<0.05,**P<0.01

2.3Western-blot检测Ghrelin、mTOR及下游基因p70s6k在胃组织中表达水平 肥胖模型组大鼠胃组织中p-mTOR和p-p70s6k蛋白表达增加(P<0.05);减重术后,胃组织中Ghrelin、p-mTOR和p-p70s6k蛋白表达降低(P<0.05)。各组间mTOR和p70s6k蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明,减重手术可下调Ghrelin蛋白的表达。见图2。

图2 大鼠胃组织中Ghrelin、p70s6k、p-p70s6k、mTOR、p-mTOR蛋白表达水平(n=3)注:A为Western-blot检测Ghrelin、p70s6k、p-p70s6k、mTOR、p-mTOR蛋白条带图,B为蛋白条带的统计分析图;#为与肥胖模型组相比P<0.05,*为与假手术组相比P<0.05

3 讨论

随着人民生活水平的提高,肥胖这一“富态”疾病呈逐年增长的趋势。大量研究表明,肥胖与饮食习惯、遗传、缺乏运动、生活环境、精神压力、药物等因素密切相关。本研究通过构建食源性肥胖大鼠模拟不良饮食习惯引起的肥胖,观察到大鼠在同样足量的食物和水的环境中,在饲养时明显偏好于高脂饲料,且摄食量较单纯普通饲料组增加。肥胖大鼠行减重手术后,在身体痊愈后恢复至正常饮食,摄食量明显下降,术后体质量显著下降,说明减重手术可有效减轻肥胖大鼠的体质量,能够影响其摄食量。

近年临床研究已证实减重手术可有效降低患者的体脂,下调患者术后血脂水平,改善患者术前的非酒精性脂肪肝病,控制术前的高血压,对2型糖尿病有一定的控制和治疗效果[8]。本实验结果发现,减重术后肥胖大鼠血脂水平下降,数值上接近对照组。

Ghrelin作用于下丘脑,可产生食欲、增加能量储存、促进脂肪沉积,且主要在胃组织中表达。目前有研究发现,通过袖状胃切除术可显著降低血浆Ghrelin,降低患者术后对于高脂高热量食物的欲望[9-10]。临床病例报告显示,减重术后空腹Ghrelin水平下降,1年后不再下降[11]。动物研究结果显示,减重术后大鼠体内Ghrelin水平下降,且与术后的前3个月体质量下降呈正相关[12]。本研究也表明,减重手术可导致大鼠胃组织中Ghrelin表达量降低,血清三酰甘油和总胆固醇含量下降,因此减重手术实现血脂、摄食量和体质量降低可能通过调控Ghrelin表达实现。

mTOR信号通路可调节控制下丘脑能量平衡[13],该信号通路与病理性肥胖有关,且相关研究发现mTOR/p70s6k基因敲除的小鼠免受饮食诱导肥胖的影响[14]。近年研究发现胃内由mTOR信号通路协调胃大麻素系统和生长素释放肽相互作用完成的食物摄入调节机制。饮食肥胖型小鼠的Ghrelin和大麻素调节参与大麻素系统-迷走神经的传入饱腹感信号通路的受体和分解酶被破坏,这可能导致肥胖动物迷走神经的敏感性发生变化[15]。研究表明,减重手术可造成mTOR/p70s6k信号通路的变化[16]。本研究结果表明,减重手术可导致mTOR/p70S6k通路抑制,Ghrelin下调。

综上所述,减重术后大鼠体质量减轻、食欲下降的可能原因是mTOR/p70s6k通路相关蛋白表达下调,从而降低Ghrelin的表达,该结果为减重术后体质量下降增加理论依据,对临床减重手术的应用具有指导意义。