百里醌对化学诱导的溃疡性结肠炎的保护作用

吴 磊, 李广莹, 闫永平, 肖桂然

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

肠炎是目前全球范围内发病最多、分布最广泛的疾病之一,严重影响人们的健康、生活和工作,给个人、家庭和社会带来严重的经济负担。炎症性肠病是指以胃肠道慢性炎症为特征的克罗恩病(Crohn disease)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)2种疾病。克罗恩病导致胃肠道任何部分的跨壁溃疡,最常影响回肠和结肠的末端。UC包括结肠黏膜的弥漫性炎症,最常累及直肠(直肠炎),但也可能延伸至乙状结肠(直乙状结肠炎)、超出乙状结肠(远端溃疡性结肠炎)或包括整个结肠进入盲肠(全结肠炎)[1]。如果炎症性肠病治疗不彻底,那么可能会引起消化吸收功能差、营养不良、肠黏膜溃疡引起出血等诸多后果。近年来,国内外医学界越来越重视对肠炎的诊疗,许多研究者都对肠炎诊疗方案进行优化和推陈出新。调查研究显示,饮食不当在促进肠炎发生发展中起到关键性作用。研究发现,有些人类膳食中的活性成分对肠炎具有良好的防治作用,其机制与抗炎、抗氧化、免疫调节等有关[2]。因此寻找并研究这类活性物质意义重大。

毛茛科一年生草本植物黑种草种子常用于传统医疗各种疾病,如胃肠道疾病、头疼、高血压、支气管哮喘等疾病[3]。百里醌(thymoquinone, TQ)是从黑种草种子中提取的活性物质,化学名称为2-异丙基-5-甲基-1,4-苯并醌,分子式为C10H12O2。研究发现TQ具有抗氧化、抗炎症和抗肿瘤等作用,对正常细胞毒性很小[4],可用于多种疾病的治疗,例如TQ能够抑制由乙酸诱导的大鼠结肠炎[5],治疗实验性风湿性关节炎[6],抑制鼠脓毒性腹膜炎[7]。

果蝇是遗传和发育研究中重要的模式生物之一,其特点是生长发育周期短,饲养方便,其组织与器官结构与哺乳动物相对应,例如其中肠与哺乳动物的小肠类似,其马氏管与肾脏类似[8]。果蝇已被应用于帕金森、阿尔兹海默症、肿瘤、炎症等多种疾病的研究中,并取得显著成果。

目前,多种动物实验模型被广泛用于研究炎症性肠病的病因、发病机制及测试新开发药物药效等,尤其以葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的UC模型应用最广。DSS诱导的果蝇肠炎模型的病因、临床症状、病理改变及治疗效果均与人类UC相似,可用于研究UC病因、发病机制[9]。肠道上皮是抵御环境压力(包括有毒化学物质)的重要防御系统,肠道完整性的破坏是多种肠道疾病的主要原因之一[10]。TQ已被证实在放射性射线诱导的肠屏障破坏中起保护作用[11],然而,其对有毒化合物诱导的炎症的防御效果研究不多。本研究利用DSS诱导的果蝇UC模型,探究有毒化学物质诱导肠炎的机制,并从营养的角度探讨TQ对有毒化学物质诱导的肠道破坏的保护作用,研究结果为天然物质预防及治疗炎症性肠病提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

野生型果蝇W1118购于维也纳果蝇中心(ViennaDrosophilaResearch Center);DSS、亮蓝购于上海麦克林生化科技股份有限公司;TQ购于美国Sigma;其他试剂均为分析纯。

酶标仪(澳大利亚INFINITE MNANO);倒置荧光DIC显微镜(日本Nikon);超敏化学发光成像系统(美国ProteinSimple公司)。

1.2 果蝇培养及寿命测定

在25 ℃、60%湿度下,光照12 h、黑暗12 h循环培养。对照组在玉米酵母标准食品上培养。

黑腹果蝇在25 ℃、60%湿度下进行12 h/12 h光/暗循环培养。24 h内采集新羽化成蝇。每2～3 d将50只成虫培养并转移到装满新鲜食物的新瓶子中。每天统计存活蝇数,实验重复3次。

1.3 以DSS构建果蝇肠炎模型

将W1118野生型果蝇随机分为对照组和实验组,对照组给予果蝇正常食物(normal food,NF),实验组在果蝇的膳食中加入一定浓度TQ,挑2组果蝇子一代,将子一代果蝇分别给予5% 蔗糖(SUC)、5%SUC+4%DSS处理,构建果蝇肠炎模型。

1.4 存活率的测定

以NF或含TQ的食物饲养3～5 d的新羽化果蝇(雌、雄各30只),饥饿2 h,转移到含有5%SUC+4% DSS毒性化合物的2层滤纸的小管中。所有实验均以不添加DSS的5%SUC溶液为阴性对照。滤纸和溶液每24 h更换1次。每天更换滤纸,监测存活率。实验重复3次。

1.5 攀爬能力的测定

在温度为25 ℃、湿度为60% 的环境光下进行实验。10只新羽化(3日龄)的果蝇喂食添加或不添加DSS(4%)的SUC(5%)溶液24 h。用足够的力量将果蝇移到内底面,用非常轻的力度反复敲击圆柱体上的封闭泡沫垫。每次实验从最后一次拍打果蝇开始,持续6 s,并统计超过8 cm高度的果蝇数量。实验重复3次。

1.6 果蝇肠道形态和通透性的测定

10只新羽化的(3日龄)雌蝇暴露于4%DSS 72 h,在1×PBS中解剖,立即在荧光显微镜下观察并记录肠道形态。

为了评价添加TQ对肠道通透性的影响,将果蝇分别饲喂TQ(100 μmol/L)和NF作为实验组与对照组。添加亮蓝制成质量分数为2.5%的染色培养基,将实验组与对照组新羽化的雌蝇每隔1 d饥饿2 h,用滤纸浸泡DSS/SUC溶液处理6 h,然后将果蝇转移到亮蓝染色的食物中,处理7 d后拍摄记录果蝇身体状态。

1.7 数据统计与分析

所有数据的统计分析和图形显示均使用GraphPad Prism 8.0进行。组间比较采用t检验,多组采用单因素方差分析(ANOVA)。统计结果以(平均值±标准差)表示。显著性水平P<0.05(*),P<0.01(**),P< 0.001(***)。

2 结果与分析

2.1 TQ对野生型果蝇寿命的影响

环境压力和氧化压力是导致组织稳态下降和功能退化的主要原因,也加速了黑腹果蝇的衰老[12]。据报道,TQ具有抗氧化能力。为了验证TQ对氧化应激损伤的缓解作用,本文研究TQ对黑腹果蝇寿命的影响,如图1所示。

图1 TQ 对野生型果蝇寿命的影响

为了研究TQ对黑腹果蝇的影响,野生型果蝇W1118在标准玉米粉培养基含或不含TQ(100 μmol/L)上饲养,发现长期喂食TQ显著提高了雌、雄果蝇的寿命,分别比对照组提高11.3%和9.8%,显著延长了果蝇寿命。

2.2 TQ对摄入DSS果蝇存活率的影响

DSS诱导的UC可损伤成蝇的肠道,使黑腹果蝇的存活时间缩短,如图2所示。由图2可知,与NF-DSS组相比,添加TQ(100 μmol/L)可显著提高DSS组的存活率;TQ-DSS组与NF-DSS组相比,雌、雄果蝇存活率分别提高了12.5%和20.0%。

图2 TQ对UC模型果蝇存活率的影响

2.3 TQ对摄入DSS果蝇攀爬能力的影响

攀爬能力是衡量果蝇活力的一个指标。TQ对摄入DSS果蝇攀爬能力的影响如图3所示。

图3 TQ对UC模型果蝇攀爬能力的影响

由图3可知,经DSS处理48 h后,NF-DSS组果蝇攀爬能力较NF-SUC组显著降低(雌性下降75%,雄性下降29%);添加TQ提高了攀爬能力(雌性提高41%,雄性提高22%)。结果表明,TQ能挽救因有毒化学物质而降低的攀爬能力。

2.4 TQ对UC模型果蝇肠道形态的影响

DSS诱导的黑腹果蝇肠道损伤可引起肠道形态的改变,如图4所示。由图4可知,DSS(NF-DSS)处理果蝇的肠道长度比蔗糖对照(NF-SUC)短23%。与对照组(NF-DSS)相比,TQ-DSS组肠道长度延长13%。因此,TQ可改善因DSS诱导产生的肠道形态变化。

图4 TQ对UC模型果蝇肠道形态的影响

2.5 TQ对UC模型果蝇肠道通透性的影响

果蝇肠道屏障功能的丧失可以通过一种名为亮蓝的不可吸收的蓝色食用染料检测,当肠道通透性增加时,亮蓝会透过肠上皮从而浸染全身。为了研究TQ在维持肠道屏障完整性方面的作用,本文使用亮蓝实验评估果蝇的肠道完整性,结果如图5所示。

图5 TQ 对UC模型果蝇肠道通透性的影响

由图5可知,与NF-SUC组相比,DSS处理后,身体蓝色染色增加,补充TQ后,TQ-DSS组的果蝇身体蓝色染色明显下降。结果表明,TQ对DSS引起的肠屏障功能破坏具有保护作用。

3 结 论

TQ是一种从黑种草种子中提取的活性单萜分子,已被证实具有抗氧化、抗肿瘤和抗炎症等功能。虽然TQ的药理作用已被广泛研究和证实,但其对肠道炎症治疗的作用却鲜有报道。肠上皮细胞是维持肠内环境稳定的重要屏障,许多肠道疾病都与肠上皮细胞的凋亡有关,包括由有毒化学物质引起的溃疡性肠炎。本文通过饲喂果蝇DSS建立肠道损伤模型,从寿命、存活率、攀爬能力、肠道形态、肠道通透方面探讨TQ对有毒化合物所致UC的治疗效果。研究发现,TQ可以提高果蝇成虫的寿命,并显著缓解DSS暴露后成虫存活率及攀爬能力下降和肠道形态受损的情况,表明TQ对肠道疾病有保护作用,为天然物质预防及治疗炎症性肠病提供参考。