茶树CsGID1s基因家族的克隆及功能分析

袁连玉， 韩雨欣， 代洪苇， 郑姝婷， 童华荣

西南大学 食品科学学院，重庆 400715

赤霉素(GA)是一类重要的植物激素, 对植物芽叶的生长和茎的伸长有重要的促进作用, 植物可通过赤霉素合成和赤霉素细胞信号转导途径调控植物的生长发育过程[1-2]． 茶树是重要的叶用经济作物, 研究茶树GA信号转导及调控途径, 对解释茶树的形态建成过程, 尤其是叶片的发育非常重要． GID1s(Gibberellin insensitive dwarf1)为GA受体蛋白, 是一种可溶性蛋白, 其基因家族成员已在多种植物中被克隆研究, 如水稻[3]、 葡萄[4]、 李[5]、 柑橘[6]和百子莲[7]等, 且均定位于细胞核． GID1s受体蛋白能够识别活性GA并与之结合, 使其构象发生改变, 从而提高其与转录抑制因子DELLA蛋白的相互作用, 加速DELLA的泛素化通路[1, 7], 最终形成GA-GID1-DELLA 三聚体, 使得DELLA蛋白的抑制作用减弱, 导致DELLA蛋白被降解, 激活了植物对GA的反应[3, 8-9]．GID1s基因的表达会影响植物的株高及开花过程, 水稻过表达OsGID1基因表现出GA敏感表型, 株高增加[3]． 在杨树和拟南芥中过表达PtGID1基因也可以促使其花期提前, 株高增加[10]． 拟南芥中已被鉴定出3个具有GA受体功能的GID1s基因, 分别命名为AtGID1A,AtGID1B与AtGID1C, 他们在水解途径中都具有特殊的功能[11]． 在蛋白水解GA信号途径中,AtGID1A在茎的伸长和繁殖力中起到主要的作用,AtGID1C在茎的伸长中起到次要作用,AtGID1B在繁殖力中起到次要作用[12]． 在非蛋白水解途径中,AtGID1A在发芽和茎的伸长中起到主要作用, 在繁殖力中起到次要作用;AtGID1B在茎的伸长中起到次要作用, 在繁殖力中起到最主要的作用[13]． 此外, 龙眼GID1蛋白在种子萌发和花苞发育过程中具有重要作用[14]; 在水稻中超表达GID1a基因能使叶子保持较长时间的绿色, 从而增加植株生物量[2]; 在紫花苜蓿中GID1b基因主要作用于根和花的发育过程[15]．

茶树作为我国重要的经济作物, 其生物学形态建成对茶叶的产量和质量等有着十分重要的影响, 了解 GA在茶树中的信号转导途径有利于提升茶树的经济价值． 前人研究较少涉及茶树GID1受体对GA信号转导途径的作用, 而茶树基因组数据的公布使得CsGID1s基因家族的全基因组鉴定及功能分析成为可能． 本研究在茶树全基因组范围内鉴定和克隆了3个CsGID1s基因家族成员, 分别命名为CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C, 利用全面的生物信息学方法分析了该家族成员的特征特性, 分析验证CsGID1s基因在茶树不同品种、 不同组织及不同非生物逆境胁迫和不同浓度的外源GA3处理下的表达特征, 为茶树CsGID1s基因的功能及茶树中GA信号传导途径研究提供参考．

1 材料与方法

1.1 材料

以10年生茶树‘福鼎大白’为材料进行茶树GA受体蛋白的克隆及花和叶不同发育时期的表达分析等试验, 材料茶树种植于西南大学茶树种质资源圃内, 分别取‘福鼎大白’茶树的老叶、 芽等不同组织材料1 g, 液氮速冻后, 存储于-80 ℃超低温冰箱中备用．

试验试剂: 多糖多酚植物RNA提取试剂盒, 北京艾德莱生物科技有限公司; 一步法反转录预混液, 北京全式金生物技术股份有限公司; Taq DNA聚合酶, pMD18-T, DH5α大肠杆菌感受态细胞和DNA切胶回收试剂盒, 天根生化科技(北京)有限公司; 荧光定量PCR试剂超混液, 美国伯乐生物技术有限公司; 引物合成和基因测序, 英潍捷基(上海)贸易有限公司．

1.2 茶树GA受体蛋白家族成员的克隆

以‘福鼎大白’茶树的老叶及芽头为材料, 参照RNA提取试剂盒说明书的步骤, 提取总RNA; 经过琼脂糖凝胶及分光光度计法检验合格后, 按照一步法反转录试剂盒说明书进行RNA的反转录, 合成用于基因克隆及表达分析的cDNA模板． 克隆茶树GA受体蛋白基因, 所用引物序列见表1． PCR扩增程序: 94 ℃, 3min; 94 ℃, 30 s; 55 ℃, 30 s; 72 ℃, 2 min; 34个循环后, 72 ℃, 5min, 琼脂糖电泳, 切胶回收, 连接pMD18-T载体测序, 并与TPIA数据库中公布的序列进行比对, 确定克隆序列的准确性．

1.3 茶树GA受体蛋白家族的生物信息学分析

分 别 从 拟 南 芥 数 据 库TAIR和JGI-Phytozome 12 中下载拟南芥、 水稻、 葡萄、 杨树和紫苏柳等植物GID1s基因的核苷酸和蛋白质序列, 并利用本地Blast方法在茶树基因组数据库TPIA中鉴定并下载茶树CsGID1s基因的预测序列及其相关数据． 利用软件对CsGID1s蛋白的分子量、 等电点进行分析, 利用软件SOPM和SWISS-MODEL分析CsGID1s蛋白的结构模型, 运用软件ClustalX1.8, MEGA4.0和DNAMAN进行茶树CsGID1s蛋白的氨基酸序列比对． 采用邻接法(Neighbor-joining)构建进化树, Bootstrap参数1 000, 其余参数设置为默认值; 通过在线软件MEME分析茶树CsGID1s蛋白的保守基序, 并将最大数值设为20． 利用Plant-mPLoc进行CsGID1s蛋白的亚细胞定位分析; 利用软件Plantcare分析预测从茶树基因组数据库TPIA中下载的CsGID1s基因上游1.5 kb启动子序列中含有的顺式作用元件． 本研究还利用模式植物拟南芥AtGID1s蛋白家族在蛋白质相互作用网络数据库STRING中的相互关系网络, 分析与茶树CsGID1s相关联的蛋白．

1.4 茶树GA受体蛋白基因的表达分析

从TPIA数据库中下载了CsGID1s在‘舒茶早’茶树8个组织部位(根、 茎、 芽头、 花、 果、 嫩叶、 成熟叶和老叶)及其叶片中CsGID1s基因在盐、 冷、 干旱和MeJA等不同非生物逆境胁迫条件下的转录表达水平的数据, 并利用Tbtools绘制热图． 为了验证数据库中的基因表达量, 本研究还采用荧光定量PCR检测CsGID1s基因在茶树8个组织部位中的表达量; 为了解CsGID1s基因在茶树中的功能, 本研究对‘福鼎大白’茶树2年生扦插苗进行外源GA3胁迫处理, 分析CsGID1s基因的表达特异性． 外源GA3处理流程: 在3个蓝色方形塑料盆中, 分别加入MS液体培养基(对照), MS液体培养基+75 μmol/L GA, MS液体培养基+100 μmol/L GA, 对‘福鼎大白’茶树的扦插苗进行水培及GA处理, 分别在人工气候箱(16 h白/8 h黑, 光照强度15 000 Lx, 温度23 ℃, 湿度75%)中培养 24 h和48 h后, 对茶苗成熟度一致的第2叶进行取样, 液氮速冻后, 放入-80 ℃冰箱中保存备用． 采用多糖多酚RNA提取试剂盒方法提取样本的总RNA, 并反转录成cDNA 模板, 用于CsGID1s基因的表达特异性分析． 用Primer3软件设计荧光定量引物(表1), 内标基因为茶树肌动蛋白基因(Actin)． 10 μL Real-Time PCR反应体系: SYBR Premix 5μL, 浓度为10 μmol/L的上下游引物各 0.2 μL, cDNA 0.5 μL, 灭菌超纯水ddH2O 4.1 μL, 充分混匀, 于Bio-Rad CFX96实时定量PCR仪上进行扩增分析, 反应程序为95 ℃, 10 s; 95 ℃, 5 s; 55 ℃, 5 s, 进行40个循环． 每个样品进行3次生物学重复和3次试验重复, 采用2-ΔΔCT法分析结果, 用Sigma plot软件分析差异显著性并制图．

2 结果与分析

2.1 茶树GA受体蛋白基因家族的鉴定

为研究茶树中GA受体蛋白的功能, 本研究利用模式植物中GA受体蛋白的序列信息, 在茶树基因组数据中进行本地Blast搜索鉴定, 共获得 3个同源的茶树GA受体蛋白基因, 分别命名为CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C． 本研究以‘福鼎大白’茶树的老叶提取RNA, 进行反转录后得到的cDNA为模板, 克隆获得了2个茶树中的GA受体蛋白基因:CsGID1A和CsGID1B, 长度分别为1 041 bp和1 293 bp; 以‘福鼎大白’茶树的芽头为材料, 通过RT-PCR的方法, 克隆获得1个茶树中的GA受体蛋白基因:CsGID1C, 长度为1 023 bp(图1)． 生物信息学方法分析3个基因的核苷酸和氨基酸序列, 结果表明其分别编码346 aa, 430 aa, 340 aa长度的氨基酸残基, 分子量分别为39.42, 48.42和38.53 kDa; 蛋白的等电点分别为8.31, 5.97和5.63; 亚细胞定位预测分析显示, 3个GA受体蛋白均定位于细胞核, 这与模式植物中的GA受体蛋白的亚细胞定位信息一致(表2)． 染色体定位分析结果显示, 3个CsGID1s基因分别定位于茶树(‘舒茶早’)的2号, 6号和7号染色体(图2)．

M为分子标记, A为CsGID1A, B为CsGID1B, C为CsGID1C．

图2 茶树CsGID1s基因的染色体定位

表2 茶树基因组中的GA受体蛋白家族成员及其理化性质

2.2 茶树GA受体蛋白系统发育及蛋白保守结构域组成

系统进化树分析结果显示, 茶树中的3个GA受体蛋白与其他植物中的该蛋白氨基酸序列具有高度的保守性, 其中茶树中的CsGID1s蛋白与葡萄的VvGID1s蛋白的亲缘关系最近(图3)． 保守结构域分析结果还显示, GID1s蛋白家族成员在不同植物中具有高度的保守性, 不同植物GIDs蛋白序列中含有保守基序的种类和数量基本一致, 只存在极少数保守序列差异． 茶树中的3个GA受体蛋白也是一样, 除了CsDID1s蛋白的N端有一段不含保守基序的序列外, 其余均与其他植物中已知的GID1s蛋白一致, 具有极其相似的保守基序． 为了进一步分析这些保守基序的特征, 本研究将多种植物中GID1s蛋白进行了多序列比对(图4), 结果发现茶树中的3个GIDs蛋白具有GA受体蛋白所具有的几乎所有保守结构域, 如GID1类蛋白含有TWVLIS, LDR, FFHGGSF, HS, IYD, YRR, DGW, GDSSGGNI, GNI, MF, LDGKYF, WYW和GFY这13个功能结构域[8]; 也包括GID1和HSL家族的保守域HGG和GXSXG, 以及HSL家族中催化3联体氨基 Ser(S), Asp(D)和His(H), 但CsGID1B氨基酸序列中H发生突变, 被V取代, 导致HSL蛋白失去生物催化活性[8-9]． 与其他GID1一样, CsGID1A和CsGID1C氨基酸序列中H被I取代． 以上结果均证明, 本研究中克隆获得的3个CsGID1s蛋白均为典型的GA受体蛋白, 可能具有类似的功能．

不同颜色的方块和数字代表不同的保守基序: AtGID1s为拟南芥GID1s蛋白, OsGID1s为水稻GID1s蛋白, VvGID1s为葡萄GID1s蛋白, PtrGID1s为杨树GID1s蛋白, CsGID1s为茶树GID1s蛋白, SpGID1s 为紫苏柳GID1s蛋白．

▁为 GID1s和HSL家族的13个保守结构域的序列及位置; ▼为 GA受体蛋白GID1s蛋白的活性催化碱基, ▽为 HSL家族中催化三联体氨基酸的位置．

2.3 茶树CsGID1s蛋白的二、 三级结构分析

本研究还对茶树CsGID1s蛋白的空间结构特点及功能进行了分析(图5), 结果发现3个CsGID1s蛋白中, 自由卷曲所占的比例均最大, 分别为34.89%(CsGID1A), 35.26%(CsGID1B), 37.24%(CsGID1C); 其次是α-螺旋, 分别为30.83%(CsGID1A), 34.97%(CsGID1B)和29.33%(CsGID1C); 延长链和β折叠所占的比例也较大． 以已知GA受体蛋白2zsh.1为模板, 用SWISS-MODEL 在线软件分析蛋白的三级结构(图6), 结果显示CsGID1A, CsGID1B和CsGID1C 3个蛋白的空间结构非常相似, 均具有由8个 β 折叠片层和7个α 螺旋组成的GID1蛋白核心结构, 都属于α/β折叠水解酶超家族中的羧酸酯酶家族的典型三级结构, 由此可推测CsGID1s蛋白家族具有相同的生物学功能．

图5 茶树CsGID1s蛋白二级结构的预测分析

图6 茶树CsGID1s蛋白的3D空间结构

2.4 茶树CsGID1s基因的时空表达特异性分析

为明确CsGID1s蛋白在茶树生长发育中的调控功能, 本研究分析了转录组数据库中CsGID1s基因在17种山茶属植物叶片和茶树不同组织部位的表达特异性． 图7a中,CsGID1A基因在云抗10号(CSA)、 秃房茶(TF)、 厚叶红山茶(HZ)和大理茶(CTA)等的叶片中表达量较低;CsGID1B和CsGID1C基因无明显种属间的表达差异, 且其中表达量由大到小依次为CsGID1C,CsGID1B,CsGID1A． 图7b中, 在茶树的不同组织部位,CsGID1C基因的表达量均较高;CsGID1A和CsGID1B基因在芽、 嫩叶和花中的表达量较低, 在根、 茎、 成熟叶和老叶中的表达量较高, 在茶果中的表达量最高． 以上结果表明, 3个CsGID1s基因可能在茶树的不同组织中发挥的功能存在差异．

2.5 茶树CsGID1s基因响应非生物逆境胁迫的表达特异性分析

为了进一步明确CsGID1s基因的功能, 本研究从TPIA数据库中获得了CsGID1s基因响应NaCl、 干旱、 MeJA和冷等不同非生物逆境胁迫的转录组数据, 并分析了其表达特异性(图8)． 在NaCl和干旱胁迫条件下,CsGID1A基因的表达是升高的,CsGID1B和CsGID1C基因的表达是被抑制的． 在冷胁迫条件下,CsGID1A基因的表达受到抑制,CsGID1B基因的表达受到诱导,CsGID1C基因的表达无明显变化． 在外源JA 激素的胁迫下,CsGID1B基因的表达在24 h时略有升高, 48 h后又恢复正常;CsGID1A和CsGID1C基因的表达基本不受影响, 变化不明显． 由以上结果可以推测, 茶树CsGID1s基因可能参与了茶树应对盐、 干旱和冷等非生物逆境胁迫的响应过程, 但对外源JA激素的响应较小．

蓝色代表低表达, 红色代表高表达． a图中N0, N24, N48和N72为200 mol/L NaCl处理0 h, 24 h, 48 h, 72 h; b图中CK为未冷驯化处理对照, CA1和CA3分别为完全驯化和去驯化; c图中J0, J24, J48和J72分别为MeJA处理0 h, 24 h, 48 h和72 h; d图中P0, P24, P48和P72分别为25% PEG处理0 h, 24 h, 48 h和72 h．

2.6 CsGID1s启动子片段顺式作用元件分析

为进一步分析CsGID1s基因的功能, 本研究分别下载该基因家族成员的启动子序列, 并运用在线软件Plantcare进行分析．CsGID1s基因启动子中含有多个顺反子元件(表3), 其中CAAT-box和TATA-box常规关键顺反子元件的数量较多． 在CsGID1B和CsGID1C基因启动子中分别含有1个能够参与赤霉素GA响应的TATC-box和P-box顺反子元件． 在该家族基因的启动子序列中含有较多的光响应元件, 如chs-CMA2a, Box 4, AT1-motif, GATA-motif, GA-motif和GT1-motif． 另外, 在CsGID1s基因启动子序列中还含有响应干旱、 冷和厌氧等外界非生物逆境及外界外源激素诱导的元件． 由以上结果可以推测,CsGID1s基因家族成员可能参与了赤霉素的代谢过程, 并且可能广泛参与茶树对外界非生物逆境的响应过程．

表3 CsGID1s启动子顺式作用元件预测

2.7 茶树CsGID1s蛋白的相互作用网络分析

本研究还利用拟南芥同源的AtGID1s蛋白进行了CsGID1s蛋白相互作用关系网络的预测分析． 图9显示, 茶树CsGID1s蛋白间均存在相互作用关系, 而与其存在相互作用关系的蛋白均与赤霉素GA的合成、 结合及其运输等代谢过程有关, 其中包含DELLA蛋白(RGA1, RGL1, RGL2, RGL3及GAI 等), GA3, SLY1及 GA3OX1 等． 由此可推测, CsGID1s蛋白可与GA吸收、 转运、 代谢相关的蛋白相互作用, 共同调控茶树对赤霉素GA的代谢过程．

图9 依据拟南芥同源蛋白推测茶树CsGID1s相互作用的蛋白网络

2.8 茶树CsGID1s基因表达特异性分析

为了进一步分析茶树CsGID1s基因的功能, 本研究还利用荧光定量PCR分析了该基因家族在茶树叶片和花中不同发育阶段的表达特异性． 图10显示,CsGID1C基因在叶片不同发育时期的表达量均高于CsGID1A和CsGID1B基因． 在叶片由芽头→嫩叶→成熟叶→老叶的发育过程中,CsGID1s基因的表达先升高再降低, 在芽头、 成熟叶和老叶中的表达量要低于嫩叶(CsGID1A除外)． 该部分基因的表达规律与图7数据库中的转录组数据不一致, 可能是因为材料属于不同品种和采样时对叶片成熟度的定义有关． 图11中,CsGID1B基因在花不同发育时期的表达量均远低于CsGID1A和CsGID1C基因; 在花由花苞→露白→初开→全开→盛开的发育过程中,CsGID1s基因的表达也是先升高再降低, 在花的初开和全开时期的表达量要远高于其他时期． 由以上结果可知,CsGID1s基因的表达存在时空特异性．

小写字母不同表示p<0.05, 差异有统计学意义．

小写字母不同表示p<0.05, 差异有统计学意义．

2.9 茶树CsGID1s基因响应外源赤霉素GA3的表达特异性分析

为了解CsGID1s基因的功能, 本研究对2年生‘福鼎大白’茶苗进行了外源GA3的胁迫处理, 并分析了胁迫处理后的CsGIDs基因的表达情况(图12)． 与对照MS培养的茶苗为对照, 在75 μmol/L GA3处理24 h后,CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C基因的表达均受到抑制, 表达量下降; 在75 μmol/L GA3 处理48 h后,CsGID1A和CsGID1B基因的表达继续受到抑制, 表达量较低, 而CsGID1C基因的表达受到诱导, 表达量被上调． 在100 μmol/L GA3处理24 h后,CsGID1A,CsGID1B基因的表达量下降, 但在处理48 h后, 该2个基因的表达会被明显上调; 在100 μmol/L GA3处理24 h, 48 h后,CsGID1C基因的表达均受到诱导, 表达量被明显上调． 以上结果推测, 茶树中CsGID1s基因的表达在不同浓度GA3的不同处理时间时其表达量是不一致的, 较为明显的规律为低浓度外源GA3, 处理时间较短时,CsGID1s基因的表达受到抑制; 高浓度外源GA3, 处理时间较长时,CsGID1s基因的表达会被诱导, 表达量明显被上调．

小写字母不同表示p<0.05, 差异有统计学意义．

3 讨论

自20世纪50年代GA被列入植物激素以来, 人们对其在植物中调控植物生长发育及代谢途径的机理方面进行了很多研究, GID1s蛋白作为GA受体, 也被广泛探讨． 2005年,GID1s基因最早在水稻中被分离出来[3], 拟南芥中被发现了3个GID1s同源基因[16]． 目前, GID1s蛋白已经在多种植物中被克隆获得, 本研究利用已公布的茶树基因组数据库, 在全基因组水平上分析鉴定, 并从‘福鼎大白’茶树中克隆获得3个CsGID1s基因:CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C, 其分子量、 等电点与其编码区长度均与拟南芥中 GID1s 蛋白具有高度的同源性, 且均定位于细胞核(表2)． 茶树中的GIDs蛋白的数量与拟南芥相同． 茶树的3个CsGID1s蛋白的二级结构、 三级结构与拟南芥[16]、 水稻[3]、 葡萄[4]等植物的GID1s蛋白高度相似, 含有植物GID1s家族成员的TWVLIS, LDR, FFHGGSF, HS, IYD, YRR, DGW, GDSSGGNI, GNI, MF, LDGKYF, WYW和GFY等多个在植物生长发育过程中起重要调控作用的特征性结构域(图4), 说明茶树的CsGID1s蛋白也高度保守, 是参与茶树GA信号转导相关的生长发育过程调控的重要蛋白．

GID1s受体广泛参与种子萌发、 茎的伸长、 花器官分化及果实发育和逆境胁迫响应等植物生长发育过程的调控． GID1s可打破唐菖蒲、 山药的种子休眠过程, 促进萌发[17-18]; 龙眼GID1蛋白能促进植株增高, 促进花苞发育[14]; 辣椒GID1可以促进茎的伸长[19]． 此外, 还发现葡萄中该基因对单性结实及果实形成过程有重要作用[20], 在茶树中越冬芽解除休眠与GA及其受体基因也有关系[21]． 茶树CsGID1s基因在不同组织部位中的表达量不同, 且在叶片和花的不同发育阶段其表达量也有明显不同, 说明CsGID1s基因在茶树不同组织及不同发育时期通过调控不同的代谢途径而发挥不同的生理功能． 在16种不同的山茶科植物中, CsGIDs的表达量也存在明显差异, 这可能与不同的属种间发芽早晚、 开花多少等生理特性有关．

启动子顺式作用元件分析发现, 茶树CsGID1s基因的启动子序列中均含有GA相应元件, 另外还含有逆境胁迫响应元件． 使用外源GA3对茶苗进行胁迫处理, 在低浓度、 处理时间较短时,CsGID1s基因的表达受到抑制; 在高浓度、 处理时间较长时,CsGID1s基因的表达会被诱导, 推测CsGID1基因的转录水平受到GAs的反馈抑制调节, 该结论与板栗[22]、 棉花[23]、 葡萄[4]的研究结果一致． 且茶树CsGID1s蛋白还能与赤霉素GA的合成、 结合及其运输等代谢过程有关的DELLA, GA3, SLY及GA3OX1等蛋白相互作用, 共同参与茶树的GA信号转导过程． 由此可知, CsGID1s家族成员参与茶树对外源GA及其他非生物逆境的响应过程．

系统进化关系表明茶树与葡萄亲缘关系最近, 两者同属双子叶植物, VvGID1s蛋白通过赤霉素信号转导途径来调控葡萄果实发育, 从而为无籽葡萄的生产提供理论依据[24]． 本研究推测茶树CsGID1s蛋白可通过赤霉素GA信号转导途径调控茶树生殖生长与营养生长的转化过程, 对茶树增产等经济价值有着十分重要的意义． 此外, 茶树中GID1s蛋白对茶树形态学建成及抗逆过程起着重要的调节作用, 进一步研究GA受体在茶树生长发育过程中的调解机制对茶树果实的发育以及茶芽越冬管理有着十分必要的参考价值．

4 结论

本研究从茶树基因组中克隆获得3个茶树GA受体蛋白基因:CsGID1A,CsGID1B和CsGID1C． 茶树CsGID1s蛋白具有高度的保守性;CsGID1s基因存在组织表达时空特异性, 且受到外源GA3和其他非生物逆境的影响． 根据本研究结果推断CsGID1s基因家族成员广泛参与了茶树中赤霉素GA信号转导途径及其他非生物逆境胁迫的响应过程, 为深入分析茶树GA受体蛋白的功能提供了一定参考．