基于转录组学的粉葛葛根素生物合成相关基因挖掘

周豪楠　马喜玲　涂志伟　李林桐　胡远锋　肖旭峰　罗莎　范淑英

摘要：挖掘与粉葛葛根素生物合成的相关基因，为相关控制基因的验证及深入研究提供理论参考。对6个生长时期的粉葛块根进行转录组测序，在葛根素含量最高时期与最低时期初步筛选差异表达基因，对各时期葛根素及其上下游代谢物含量变化趋势与差异表达基因相对表达量进行相关性分析，最终挖掘出相关性较高的基因片段。结果表明，经2步筛选差异基因后，挖掘11个与粉葛葛根素生物合成相关的片段，共编码3个基因，分别为异黄酮羟化酶控制基因（I2′H）、异黄酮7-O-葡糖苷转移酶控制基因（IF7GT）和异黄酮合酶控制基因（IFS1），其中I2′H、IF7GT、IFS1均与葛根素的生物合成呈现正向相关，即均正向调控葛根素的生物合成。说明I2′H与IF7GT所编码的酶主要负责调控大豆苷元向芒柄花素和大豆苷的合成，两者同为葛根素上游代谢物的支链代谢物，因此与葛根素的含量呈正向相关，而IFS1则通过调控2，7，4′-3-羟基异黄酮的生物合成与异甘草素向葛根素的直接合成，最终调控葛根素生物合成进程。

关键词：粉葛；葛根素；转录组；异黄酮羟化酶控制基因；异黄酮7-O-葡糖苷转移酶控制基因；异黄酮合酶控制基因

中图分类号：S188文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2023）05-0030-08

粉葛（Pueraria montana var. thomsonii）属豆科葛属，它在我国的栽培史可追朔至南梁（公元502年）以前，自此之后对粉葛的炮制方法也日新月异，期间出现过捣为末法、蒸焙法、炒法、煨法等［1］。《神农本草经》中释义主消渴，起阴气，解诸毒；《本草纲目》中，释名：葛、鸡齐、鹿藿、黄斤，根部供食，鲜食可缓内热脉洪，可解酒，可升阳止泻。2001年，葛属野生与栽培作物在我国栽培面积已达40万hm2，年终产可达150万t［2］。同年，郑水庆等对粉葛主栽的云南地区进行了植物资源调查，并将云南地区现有葛属作物细分为9类，根据其主要的药用价值黄酮类物质进行排名，以野葛药用价值最高，粉葛次之［3］。纵观世界，葛属作物栽培主要分布于亚洲东南部［4］，因此相关的葛类研究样本主要来自中国、泰国、日本等地。时至如今，相关研究显示，粉葛的淀粉含量（鲜样）可高达20%，且其中含有少量維生素与矿质元素，干物质中黄酮类次生代谢物及异黄酮类次生代谢物总量可达 500 mg/kg［5-6］。因而在新时代背景下粉葛具有了更深刻的药食兼用的含义，而其综合利用价值也相应被提升至新的维度。例如，利用粉葛株内丰富的异黄酮提取物生产靶向药物缓解心脑血管疾病［7］和利用粉葛淀粉含量高且含有微量矿质元素的性质生产保健食品等［8］。

粉葛的研究兴起较早，一方面是对粉葛体内异黄酮类代谢物代谢合成机制的研究，有学者对粉葛黄酮类代谢物起始合成的控制片段基因作了全片段克隆并在大肠杆菌中过表达，通过比对最终鉴定出粉葛基因组内存在的查尔酮异构酶（CHI）合成基因［9］；伴随这一浪潮的兴起，He 等展开了针对粉葛异黄酮代谢通路的基因组研究，通过建立表达序列标签（EST）文库及相关片段的过表达（表达序列标签），成功从粉葛内鉴定出查尔酮合酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、查尔酮还原酶（CHR）、2′-羟基异黄酮脱水酶（2′HID）的控制片段基因［10］；羽健宾等成功从粉葛内克隆出了查尔酮合酶（PtCHS）基因的全片段，片段全长1 179 bp，编码了389个氨基酸［11］；Li等的研究表明，在粉葛块根内异黄酮的积累伴随着PIUGT1基因的高度表达，因此，他们认为该7-O葡萄糖苷转移酶的编码基因对异黄酮在粉葛体内的生物合成起关键控制作用［12］。另一方面，关于粉葛药用价值的研究从未间断过，其中被关注最多的是粉葛块根内的葛根素，由于其具有广泛的药理特性［13］，在血管扩张［14］、心脏保护［15］、抗氧化［16］、抑制乙醇吸收［17］等领域皆有应用。现如今的研究进展［18-19］中认可度较高的粉葛生物合成通路有2个（图1），一是大豆苷元在一个糖苷转移酶（GT）的催化下最终在大豆苷元8号C原子位增加一个糖苷，该通路的葛根素生物合成主要受到大豆苷元含量的控制；另一个是大豆苷元的上游产物2，7，4′-3-羟基异黄酮在GT的催化下形成三羟基异黄酮8-碳葡萄糖苷，随后在脱水酶（HID）的作用下形成葛根素。

目前，研究报道均集中在异黄酮类代谢物在粉葛块根内的生物合成机制，但关于粉葛葛根素生物合成的机制方面却鲜有报道。为进一步研究葛根素生物合成的机制，试验通过对6个生长时期的粉葛块根进行转录组测序，与各时期目标代谢物含量进行联合分析，从而挖掘出与葛根素生物合成最为相关的基因，以期为后期遗传转化试验的验证和最终探索葛根素生物合成的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验样本 江西主栽粉葛品种赣葛一号。

1.1.2 试验器材 高效液相色谱仪LC-20AT（日本SHIMADZU公司）、反相色谱柱C18 4.6 mm×250 mm（日本SHIMADZU公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样本获取 样本于2021年栽培于江西省宜春市奉新县棚下试验基地，基肥为1 800 kg/hm2有机肥料，定植后于每月的第1天施600 kg/hm2液体肥（氮、磷、钾含量均为20%），于2021年6—11月每月的30日收取供试样本，并于2021年12月开展试验（编号及取样说明见表1）。

1.2.2 葛根素、大豆苷元、大豆苷含量测定 测定方法参考Cherdshewasart 等的方法［20］。

1.2.3 转录组测序 无参考基因转录组测序由北京百迈克生物科技有限公司完成。

1.2.4 RT-qPCR验证 使用华越洋RNA提取试剂盒提取总RNA，使用TaKaRa RT-PCR kit试剂盒对目标片段进行相对表达量测定。

1.3 数据分析与制图

使用SPSS 21.0软件进行数据分析，使用GGplot2、Origin 2022 pro软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 粉葛块根内葛根素、大豆苷元、大豆苷的含量

由图2可知，粉葛块根内葛根素含量总体呈现先增后降的趋势，GP7R时期粉葛块根内葛根素含量最高，达到了12.35 mg/100 g（鲜质量）；GP8R与GP9R时期葛根素含量整体无明显变化，但均显著低于GP6R与GP7R时期，在GP10R与GP11R时期时，粉葛块根内葛根素含量持续下降。大豆苷和大豆苷元作为葛根素生物合成途径上游2，7，4′-3-羟基异黄酮的分支产物，其含量变化也总体呈现先增后降的规律，不同的是大豆苷含量在GP8R时期达到峰值，而大豆苷元含量则与葛根素含量变化趋势大体一致。

2.2 粉葛转录组测序结果分析

以Illumina测序平台对6个生长时期粉葛块根样本进行全长转录组测序，获得全长非嵌合序列177 535条。对全长非嵌合的Unigene进行聚类得到高质量一致Unigenes共75 943个，对高质量一致Unigenes合并进行去冗余分析得到42 211个Unigenes，对去冗余后的Unigenes进行功能注释后共有40 650个Unigenes得到注释（表2）。各样本GC含量均高于44%，Q30均高于91%（表3）。

2.3 差异表达基因GO和KEGG通路注释分析

根据试验测得的各月份间粉葛块根内葛根素含量变化数据，选取葛根素含量变化最大的2个生长时期：7月和11月，根据转录本中被注释的Unigenes表达量的FPKM（每千个碱基的转录每百万映射读取的片段）值，以log2差异倍数（FC）≥1和错误发现率（FDR）<0.1为标准，筛选出961个差异Unigenes，其中上调表达的共549个，下调表达的共412个。根据GO注释，这961个差异Unigenes主要被注释至生物过程中的细胞过程、代谢过程和单生物过程中。根据KEGG的注释，这961个差异Unigenes也主要被注释在代谢过程的氨基酸生物合成、淀粉与糖代谢途径和碳代谢中（图3和图4）。

2.4 差异表达基因GO和KEGG富集分析

初步筛选出的961个差异表达基因在GO数据库中主要被富集在生物过程的磷信号转导系统和蔗糖代谢中（图5）；在KEGG的富集分析中选择了Q值（矫正后的P值）低于1的注释片段进行富集，并按Q值由低到高进行排序，结果显示，可信度较高的富集通路（图6）分别为异黄酮类物质生物合成、乙醛酸和二羧酸代谢、半胱氨酸-蛋氨酸代谢。

2.5 差异表达基因相对表达量分析与筛选

从上述初步筛选的差异表达基因中筛选出异黄酮代谢通路差异表达基因共13个，而后根据上述粉葛块根内葛根素、大豆苷、大豆苷元含量随月份变化的趋势规律，结合转录本所测得的异黄酮代谢通路的13个差异Unigenes的相对表达量FPKM值（归一化处理后），筛选出各月份FPKM值变化规律与代谢物产物含量数据呈正向相关的Unigenes共11个，无与代谢物含量变化呈负向相关的Unigene（相对表达量变化趋势见图7）。

2.6 代谢物与差异表达基因表达量相关性分析

图8反映出所筛选出的11个差异基因与3种代谢产物的相关性，11个基因片段均与葛根素的生物合成呈现正相关，各个片段与粉葛葛根素、大豆苷、大豆苷元的含量变化具有显著相关性。

2.7 筛选后的差异表达基因注释

根据KEGG的注释（表4），11个Unigenes有6个编码了异黄酮2′-羟化酶控制基因（K13260）、 2个编码了异黄酮7-O-葡萄糖基转移酶控制基因（K13263）、3个编码了2-羟基异黄酮合酶控制基因（K13257），结合注释可知，在粉葛的生长过程中I2′H、IF7GT与IFS1均与葛根素的生物合成存在正向相关性。

2.8 RT-q PCR验证

选取转录本筛选后具有代表性的4个差异表达基因片段（表5）进行相对表达量验证，相对表达量的表达趋势与转录本的FPKM值趋势一致（图9），说明转录本数据可靠。

3 讨论与结论

以KEGG所标注的代谢通路为参考，在试验所测得的3种代谢物的含量变化中可知，3种代谢物的含量总体均呈先增加后降低的趋势，结合该变化趋势可从961个初筛的差异基因片段中筛选出11个与葛根素生物合成呈正向相關的差异基因片段，经过注释后共编码3个基因，分别为I2′H、IFS1、IF7GT。IF7GT的主要作用为在大豆苷的7号氧原子位添加一个糖苷［21］，负责控制大豆苷元向大豆苷的合成，试验数据表明，IF7GT与3种代谢物均呈现正向调控的趋势，由此推断当该控制基因表达量增加时，控制8号碳原子位糖苷转移的控制基因的表达量也会相应增加或降低， 最终呈现正向或负向调控葛根素的生物合成，而目前关于8号碳原子位的糖苷转移酶的控制基因有研究表明是PIUGT43基因［22］；前人的研究表明，I2′H可正向调控丙二酰糖苷的积累与苯丙素类物质的合成［23］，且在异黄酮代谢通路中，I2′H主要作用在大豆苷元向2-羟基芒柄花素的生物合成中［24］，属于大豆苷元向下游代谢物合成的关键控制酶的编码基因，结合I2′H在粉葛各个生长期内的表达量变化规律和大豆苷元与大豆苷的含量变化规律可从侧面证明伴随大豆苷元含量上下起伏，其下游代谢物的合成关键控制酶的活性也相应发生变化，由此可推测控制葛根素合成的糖苷转移基因的表达量也会相应增加或降低，因而I2′H的表达量可从侧面反映葛根素含量的变化，且两者呈正相关；同理，作为大豆苷元向下代谢的支链产物大豆苷，其关键控制酶的编码基因IF7GT也呈现出了相同的正向调控规律，因此IF7GT也可从侧面反映出葛根素含量的变化，且两者呈现正相关性；IFS1则可通过葛根素合成的2种通路正向调控葛根素的生物合成，分别为控制其上游代谢物甘草素向2，7，4′-3-羟基异黄酮的转化［25］和控制异甘草素代谢合成为葛根素，以最终正向调控葛根素的合成。

試验结果（图10）表明，在粉葛中6个基因片段编码了I2′H，并正向调控了大豆苷元向支链代谢物芒柄花素的生物合成而与葛根素的生物合成存在正向相关；2个基因片段编码了IF7GT，并正向调控了大豆苷元向大豆苷的生物合成进程而与同为支链产物的葛根素的生物合成存在正向相关；3个基因片段编码了IFS1，正向调控了2，7，4′-3-羟基异黄酮的生物合成与异甘草素向葛根素的直接合成而最终表现为调控葛根素的生物合成。

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收稿日期：2022-06-16

基金項目：江西省现代农业产业技术体系-葛栽培岗资助项目（编号：050014-9021107274）。

作者简介：周豪楠（1997—），男，江苏南通人，硕士研究生，主要从事粉葛栽培及代谢机理研究。E-mail：zhnsrm@126.com。

通信作者：范淑英，教授，主要从事蔬菜栽培生态与环境调控研究。E-mail：fansy12@126.com。