兼抗黄瓜花叶病毒和马铃薯 X 病毒弱毒疫苗的创制

刘春菊　杜传印　魏军　刘宏　李斐　方敏　于成明　原雪峰

摘要：黄瓜花叶病毒（CMV ）和马铃薯 X 病毒（PVX ）在烟草中普遍存在、危害严重，对烟草产业健康发展有重大影响。为预防田间烟草上黄瓜花叶病毒和马铃薯X 病毒，需要构建能够同时预防CMV 和PVX 的弱毒疫苗。本研究首先构建了 CMV RNA2的2b 蛋白提前终止突变体 pCB301-CMVFny-R2-2bPT ，在此突变体中插入200 bp 的 PVX 保守序列（5890-6089）获得突变体质粒 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089。该突变体质粒与含野生型 CMVFny RNA1和 CMVFny RNA3的质粒等量混合后通过农杆菌浸润方法分别接种中烟100、红花大金元和林烟草，接种后烟草症状与野生型 CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3混合接种烟草症状相比显示弱侵染性。疫苗遗传稳定性检测证实疫苗载体中插入的 PVX 200 bp 保守片段稳定存在，CMV 和 PVX 强毒株系攻毒试验表明该弱毒疫苗在中烟100上对 CMV 和 PVX 同時具备交叉保护作用。

关键词：交叉保护；黄瓜花叶病毒；马铃薯 X 病毒；弱毒疫苗

中图分类号： S435.72           文献标识码： A           文章编号：1007-5119（2023）01-0044-07

Construction of an Attenuated Vaccine Against Both Potato Virus X and Cucumber Mosaic Virus

LIU Chunju1， DU Chuanyin1 ， WEI Jun1， LIU Hong1， LI Fei1， FANG Min1， YU Chengming2*， YUAN Xuefeng2*

（1. Shandong Weifang Tobacco Co.， Ltd.， Weifang， Shandong 261061， China;2. College of Plant Protection， Shandong AgriculturalUniversity， Taian， Shandong 271018， China）

Abstract： Cucumber mosaic virus （CMV） disease and potato virus X （PVX） disease major diasesese that cause great loss in tobacco production. In  order to prevent  CMV  and  PVX  an  attenuated vaccine  was  constructed  which  could prevent  CMV  and  PVX simultaneously. A mutant of CMV RNA2 named pCB301-CMVFny-R2-2bPT was constructed firstly in which the expression of 2b protein was terminated prematurely. Then an 200 bp conserved sequence （5890-6089） of PVX was inserted into pCB301-CMVFny- R2-2bPT  and  obtained  the  mutant  named  pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089. The  pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089 plasmid mixed with the plasmid containing the wild type CMVFny-RNA1 and CMVFny-RNA3 in the same amount was used to inoculate Zhongyan 100， Hongda and Nicotiana sylvestris with injection of Agrobacterium. The inoculated plants showed weak infectivity compared with the symptoms of wild type CMVFny-RNA1+RNA2+RNA3 mixed inoculation. The stability test of the vaccine confirmed that the inserted PVX 200 bp conservative fragment could exist stably. The experiments of CMV and PVX intensity strains showed that the attenuated vaccine could cross protect CMV and PVX of Zhongyan 100 simultaneously.

Keywords： cross protection; cucumber mosaic virus; potato virus X; attenuated vaccines

防治植物病毒病的最有效方法是种植抗病品种，但存在育种周期长、抗性易丧失等缺点。弱毒交叉保护是防治植物病毒病的一种有效策略，是利用弱毒刺激植物自身的免疫系统从而预防强毒株侵染的一种方法[1-2]。病毒弱毒突变体可以天然存在，也可以通过分子生物学手段人工制备获得。

黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus， CMV ）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员[3]，可侵染100多科1200种植物[4]。CMV 基因组由3条正义单链 RNA 组成，分别为 RNA1、RNA2、RNA3。RNA1约3350 nt ，含1个 ORF，编码111 kDa 的1a 蛋白。 RNA2约3050 nt，含2个位置部分重叠的 ORF，编码2a、2b 蛋白[5]。1a、2a 蛋白参与病毒复制酶复合体的形成，对侵染寄主植株的症状、传播、温度敏感性及与卫星 RNA 的互作起决定性作用[6-7]；2b 蛋白强烈抑制寄主植物转录后的基因沉默，是病毒编码的基因沉默抑制因子，对维持 CMV 的强致病性是必需的，与1a 蛋白协作于 CMV 在植物体内的长距离运输[8-10]。RNA3约2190 nt，含移动蛋白（MP）和衣壳蛋白（CP）2个 ORF，MP 决定病毒在寄主间的移动， CP 通过 RNA3的亚基因组 RNA4翻译产生，与病毒颗粒组装、蚜虫传播、症状表达及寄主抗病毒信号通路有关[11-14]。黄瓜花叶病毒的广寄主特性和基因组多样性决定了创制CMV 弱毒疫苗的广泛应用价值。此外，有的 CMV 含有卫星 RNA[15]，卫星 RNA 是 CMV 基因组以外的遗传因子，大小在307～405nt 之间，是线型单链的非编码 RNA 分子，干扰病毒的复制，影响其对寄主的致病性和症状[13，16-18]。

病毒侵染常为复合侵染，仅对一种病毒进行防治往往效果不好，多种疫苗的混合使用可能会引起疫苗间相互作用，影响防治效果，因此研制能够同时防治多种病毒的单剂弱毒疫苗对防治植物病毒病具有重要意义。但目前对于植物病毒疫苗的研制存在疫苗寄主范围窄、靶标病毒谱窄、疫苗遗传稳定性差等多种缺陷。烟草极易被 CMV 侵染，在全世界的烟草主栽区均有 CMV 的分布和危害[19]。本研究以 CMV 作为基础载体，在保持2a 蛋白完整的前提下对2b 蛋白的编码基因进行突变改造，使2b 蛋白的表达提前终止，并在新的终止密码子后插入 PVX 的200bp 保守的片段，从而得到含有 PVX 片段的 CMV 弱毒突变体，获得同时具备CMV 和PVX 交叉保护效果的弱毒突变体，以获得同时防治烟草 CMV 和 PVX 两种病毒的弱毒疫苗。

1材料与方法

1.1材料来源

1.1.1菌株与质粒含黄瓜花叶病毒 CMVFny 的 pCB301侵染性克隆质粒由南京农业大学陶小荣教授惠赠；中烟100、红花大金元、林烟草均由中国农业科学院烟草研究所惠赠。含马铃薯 X 病毒（PVX ）（NCBI 登录号 EU571480）的质粒、大肠杆菌 DH5α和农杆菌 GV3101均由山东农业大学分子植物病毒室保存。

1.1.2引物所用引物见表1。引物 Fny2-del2b 3'-BSST-2662-F 和Fny2-del2b 3'-B-2661-R 用于构建中间载体 pCB301-CMVFny-R2-2bPT ；引物 PVX-BamH I-5890-F 和 PVX-Sma I -6089-R 用于擴增烟草 PVX 基因5890-6089的200 bp 片段；引物 CM-Fny2-2510-F 和 CM-Fny2-2760-R 用于 PCR 扩增以验证异源病毒片段遗传稳定性。

1.1.3主要试剂限制性内切酶、 M-MLV 反转录酶、 T4 DNA 连接酶、 dNTP 购自 TaKaRa 公司；植物总 RNA 提取试剂 TransZol、DNA Marker 购自全式金公司；琼脂糖胶回收试剂盒购自康为世纪公司；植物总 RNA 提取试剂酚购自 Solarbio 公司。

1.2方法

1.2.1 TransZol 法提取植物总RNA 取约1 cm2大小的植物叶片于2 mL 离心管中，加入1 mL TransZol 试剂，用组织研磨仪破碎，室温静置5 min；加入0.2 mL 氯仿，剧烈振荡15 s，室温静置3 min；4 C，13000 r/min 离心15 min，取上清并加入0.5 mL 异丙醇，混匀，室温静置10 min；加入1 mL75%乙醇，剧烈振荡，4 C 13000 r/min 离心5 min，去除液体；超净工作台内晾干，溶解于20～50?L DEPC 处理的无菌水，-80 C保存备用。

1.2.2中间载体 pCB301-CMVFny-R2-2bPT 的构建构建策略见图1，具体方法如下：

（1）以 CMVFnyRNA2的侵染性克隆质粒 pCB301-Fny2为模板，引物 Fny2-del2b 3'-BSST-2662-F 和Fny2-del2b 3'-B-2661-R 反向PCR 扩增。 PCR 条件：98 C变性10 s ，55 C退火5 s ，72 C延伸8 min ，7个循环；98 C变性10 s ，68 C 延伸8 min ，25个循环；4 C保存。

（2）利用 Dpn I 酶降解（1）反应中的质粒模板 pCB301-Fny2，反应条件为：37 C，2 h；80 C，20 min；扩增产物切胶回收。

（3） BamH  I 酶切（2）的回收产物后再次切胶回收，回收产物用T4DNA 连接酶16 C过夜连接，连接产物转化大肠杆菌 DH5α，涂100?g/mL 卡那霉素的 LB 平板，37 C培养8～12h 后做菌落 PCR 和质粒酶切鉴定，阳性菌落送公司测序。

1.2.3 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089构建

（1） TransZol 法提取 PVX 毒源植物总 RNA，利用引物 PVX-Sma I -6089-R 进行反转录，反应条件：80 C 变性3 min；加反转录酶，42 C反应1.5 h。

（2）反转录产物为模版，用引物 PVX-BamH I-5890-F 和 PVX-Sma I-6089-R 进行 PCR 扩增。PCR 条件：94 C预变性2 min；94 C变性30 s，53 C退火30 s，72 C延伸10 s，30个循环；72 C延伸2 min；4 C保存；PCR 产物切胶回收。

（3）质粒 pCB301-CMVFny2-del2b 和（2）中获得的片段经 BamH I 和 Sma I 双酶切后，酶切产物回收，用 T4 DNA 连接酶16 C过夜连接；连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，经含100?g/mL 卡那霉素的 LB 平板培养， PCR 筛选和酶切鉴定后阳性菌落送公司测序。

1.2.4农杆菌注射接种（1）活化菌液：将保存于-80 C的农杆菌菌液，在含卡那霉素（Kanr ）（50?g/mL）和利福平（Rif）（100?g/mL）的固体 LB 培养基上划线，28 C倒置培养48 h ，长出单菌落。

（2）挑取单菌落在含 Kanr （50?g/mL）和 Rif（100?g/mL）抗生素的固体LB 培养基上划线28℃倒置活化培养24h，做菌落 PCR 鉴定。

（3）小摇：用灭菌牙签挑取（2）的阳性菌落，放入3 mL 含 Kanr （50?g/mL）和 Rif（100?g/mL）的 LB 液体培养基，28 C，220 r/min 水平振荡培养24 h。

（4）大摇：取300～600?L （3）的菌液，加入30 mL 含 Kanr （50?g/mL）和 Rif （100?g/mL）的 LB 液体培养基，28 C，220 r/min 水平振荡培养12 h。

（5）集菌：将（4）的菌液28 C，4000 r/min 离心15 min ，弃上清。

（6）重悬：用10 mmol/L MgCl2[加入10 mmol/L 2-吗啉乙磺酸（MES）、150?mol/L 乙酰丁香酮（AS）]农杆菌重悬液将（5）的菌重悬，调整接种混合样浓度至 OD600=0.4～0.6，28 C静置3～12 h。

（7）注射：用1 mL 一次性注射器去针头吸取1 mL （6）的菌液，在煙草叶片背面叶脉之间利用无针头注射器压力注射菌液接种，每片叶子浸润面积约为2/3，每株烟草注射2片叶，每处理注射3株烟草；注射后25 C温室培养。

2结果

2.1疫苗载体构建

2.1.1中间载体 pCB301-CMVFny-R2-2bPT 的构建菌落 PCR 鉴定的阳性质粒用BamH I 和 Sma I 进行双酶切鉴定，酶切结果显示质粒可以被这2个酶线性化，且线性化质粒长度约为7.6kb，确认得到中间载体 pCB301-CMVFny-R2-2bPT （图2）；同时质粒的 DNA 测序及序列比对证实成功插入了终止密码子和酶切位点序列（图3）。获得质粒pCB301-CMVFny-R2-2bPT。

2.1.2  含 PVX 片段的质粒突变体 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089的构建菌落 PCR 鉴定的阳性质粒用BamH I 和 Sma I 进行双酶切鉴定，酶切结果显示有约200 bp 的酶切条带，并且剩余的酶切片段大小约为7.6 kb （图4）；同时质粒的 DNA 测序及序列比对证实成功插入了 PVX 的200bp 序列（图5）。获得质粒 pCB301-CMVFny- R2-2bPT-PVX5890-6089。

2.2生物学效应验证

2.2.1 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089的生物学效应野生型 CMVFnyRNA1、CMVFnyRNA2、 CMVFnyRNA3等比例混匀作为正对照，野生型 CMVFnyRNA1、CMVFnyRNA3和 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089等比例混匀作为试验处理组，通过农杆菌浸润法分别注射侵染中烟100、红花大金元和林烟草。接种10 d 后观察症状，显示接种野生型 CMVFnyRNA1/RNA2/RNA3的3种烟草都出现叶片皱缩、植株矮化症状；接种 CMVFnyRNA1/RNA2-2bPT-PVX5890-6089/RNA3与健康对照基本一致，无明显病毒病症状。表明 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089  为 CMV RNA2的弱毒突变体（图6）。

2.2.2 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089的遗传稳定性分析为检测突变体接种烟草后的遗传稳定性，分别在接种中烟100、红花大金元和林烟草后第3、5、7、9天取被注射烟草叶片的上部叶片利用引物 CM-Fny2-2510-F 和 CM-Fny2-2760-R 做 RT-PCR 检测异源病毒插入片段。 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089接种第3、5、7、9天，在被注射烟草植株叶片上部叶片中均可检测到病毒 PVX 片段，表明接种突变体在烟草体内具有遗传稳定性（图7）。

2.2.3 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089的交叉保护效果通过农杆菌注射的方法，分别对预接种 CMVFnyRNA1/RNA2-2bPT-PVX5890-6089/RNA3及正常生长的中烟100接种 CMV 和 PVX 强病毒测试交叉保护效果测试。结果显示，CMV 和 PVX 强毒接种的健康中烟100，植株整体矮小，叶片呈现深浅绿相间花叶症状和典型的 CMV 侵染的鼠尾状特征； CMV 和 PVX 强病毒接种预接种 CMVFnyRNA1/RNA2-2bPT-PVX5890-6089/RNA3的中烟100，植株生长状态良好，株高与健康对照基本一致，叶片表现微弱花叶症状，说明预接种 RNA1/RNA2-2bPT-PVX5890-6089/RNA3的对 CMV 和 PVX 同时具有较好的交叉保护防治效果，可作为兼抗 PVX 的 CMV 弱毒疫苗（图8）。

3讨论

影响交叉保护效果的因素有很多，例如株系专化性、遗传稳定性、保护间隔期长短、与其他病毒的协生性等[20-22]。另外当弱毒突变体在体内达到一定的积累阈值时，才能够启动植物的防御反应，产生交叉保护效果，有效预防强毒株系的侵染[21]。并且，弱毒疫苗在交叉保护中是一个寄主-介体-环境相对稳定的体系，一旦这个体系发生改变，交叉保护机制就会遭到破坏甚至是弱毒变为强毒[23]。同时在病毒的不断进化中，弱毒存在恢复为强毒的可能性，RNA 病毒通过重组进化将同源或异源的病毒重组重配导致病毒致病力更强、寄主范围更广[24-25]。因此，对于弱毒疫苗的研究应用需要从多个角度多个层面验证。本研究中创制的弱毒疫苗预接种烟草10 d 后用靶标强毒株系进行攻毒，发现预接种弱毒突变体的植株再进行靶标强毒接种比直接接种强毒的植株长势优、株高正常、叶片生长状态良好，说明弱毒突变体在接种后10 d 在体内达到了一定量的积累，能预防靶标强毒株系的侵染，起到交叉保护效果。本研究中通过农杆菌注射的方法进行的疫苗接种，疫苗接种量大，效果明显，田间自然发病的病毒剂量远远低于试验处理浓度，因此对接种疫苗浓度还需要进行优化提高利用效率同时降低成本。本研究对疫苗的遗传稳定性做了初步室内验证，研究结果表明室内条件下弱毒疫苗在10 d 内遗传稳定。但是，遗传稳定性以及病毒的重组重配是受多种机制因素影响的，所以对于疫苗的遗传稳定性研究还需要进行不同环境条件不同寄主以及不同时间等多方面的研究验证。目前所有数据均为室内试验获得且环境相对单一，在田间生产中自然环境的多样性会对病毒发生及疫苗效果产生较大的影响，弱毒疫苗的田间应用效果还需进一步验证。

4结论

本研究构建了含马铃薯 X 病毒（PVX）片段的黄瓜花叶病毒（CMV） RNA2弱毒突变体质粒载体 pCB301-CMVFny-R2-2bPT-PVX5890-6089，该质粒载体与含野生型 CMVFnyRNA1和 CMVFnyRNA3的质粒通过农杆菌浸润方法混合接种中烟100、红花大金元以及林烟草等品种，证明插入的 PVX 200 bp 保守片段在突变体中稳定存在，并显示弱致病症状。在中烟100中验证了该疫苗同时具备对 CMV 和 PVX 的交叉保护效果。

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