电化学生物传感器在病毒性传染病检测中的应用

彭雪，金政，林玉红，周瑶，赵凯

（1.齐齐哈尔大学生命科学与农林学院，齐齐哈尔 161000；2.台州学院生命科学学院）

病毒是具有传染性的专性细胞内寄生，只能通过电子显微镜观察到的小型微生物（直径20～400 nm），其基因组由DNA 或RNA 组成[1-2]。在进化过程中，病毒发展出多种机制[3]，所有的细胞生命都可能被病毒感染，病毒可引发人类和动物多种疾病，如普通感冒（Common cold）、唇疱疹（Herpes labialis）[4]、麻疹（Measles）[5]、肝炎（Hepatitis）[6]等。也有一些更有害甚至危及生命的病毒包括口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMV）[7]、禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）[8]、猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）[9]、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）[10]、冠状病毒（Coronavirus）[11]、狂犬病毒（Rabies virus，RV）[12]、人体免疫缺陷病毒（HIV）[13]、埃博拉病毒[14]（Ebola virus，EV），以及新型冠状病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）[15]等，对全球人类和动物安全构成了巨大威胁，同时也造成了不可估量的经济损失。早期诊断是预防疫病和有效控制疫病传播的关键。因此，迫切需要快速、准确、高灵敏且便捷的检测技术来诊断引起疫病的病毒。

生物传感器是一种分析装置，由生物受体、传感器和信号处理器组成，用于检测、传输和记录分析物的生理或生化变化，是解决临床诊断中的灵敏度低、成本高等问题最具潜力的方法之一[16-17]。根据生物传感器分类方式的不同，可将其分成很多类型（见表1）。其中，电化学生物传感器由于其选择性高、灵敏度好、低成本等特点，引起了研究者们的广泛关注，是目前研究和应用最广泛的生物传感器之一[18-19]。因此，综述电化学生物传感器检测病毒技术的发展，对促进电化学生物传感器在病毒等病原微生物检测领域中的推广应用具有重要的借鉴意义。

表1 生物传感器分类Table 1 Classification of biosensors

1 电化学生物传感器检测原理及分类

电化学生物传感器是一种通过将生化反应转化为定量电信号来检测被分析物的分析装置。它将生物识别分子（如抗体）的特异性与电化学检测技术的优势相结合[32]。电化学生物传感器由生物识别元件、物理化学信号转换器和数据分析仪三部分组成（图1）。电极是转换元件和固定载体，抗体、酶、细胞等生物识别元件通过化学或物理方法固定在电极表面。

图1 电化学传感器组成简图Fig.1 Composition diagram of electrochemical sensor

电化学生物传感器的检测原理则是将生物活性物质作为分子识别物固定在电极表面，由于识别元件与待测分子的特异性识别，信号转换器将目标分子及其响应信号转换为电流、电位等电信号，从而实现对目标待检物的定性或定量检测。以电化学生物传感器检测抗原为例，检测过程示意图如图2 所示。

图2 电化学生物传感器检测过程示意图Fig.2 Schematic diagram of electrochemical biosensor detection process

迄今为止，电化学检测技术包括差分脉冲伏安法（Differential pulse voltammetry，DPV）、循环伏安法（Cyclic voltammetry，CV）、线性扫描伏安法（Linear sweep voltammetry，LSV）、电化学阻抗谱（Electrochemical Impedance Spectroscopy，EIS）和方波伏安法（Square Wave Voltammetry，SWV）等[33]。同时根据不同的分类方式电化学生物传感器也衍生出很多种类（表2）。电化学生物传感器由于具有高度灵敏、信号生成和读出速度快、所需样品少、病毒检测成本低廉，以及需要相对简单的操作仪器等优点而被广泛应用于高发且传染性强的病毒检测中。

表2 电化学生物传感器分类Table 2 Classification of electrochemical biosensors

2 电化学生物传感器在高发性病毒检测中的应用

在过去的20 年中，随着人类和家畜种群密度的增加，局部流行病和全球流行病的威胁也在增加，传染性极强的流行性疾病频发，如CSFV、FMV、AIV、Coronavirus 等高发传染性病毒，造成人类与家畜生命、健康和经济的巨大损失。尽管已经为一些有威胁的病原体开发出了有效的疫苗，但面对迅速蔓延的流行病，早期诊断对于预防和控制其源头是有效控制疾病传播的关键[42]。在过去的25 年里，电化学生物传感器已被广泛应用，为PCR 和ELISA 的病原鉴定和定量检测提供了补充平台[43]。

2.1 流感病毒（Influenza virus，IFV）

IFV 是一种急性呼吸道病毒，属于正粘病毒科[44]。根据核蛋白和基质蛋白的内部蛋白质，IFV 分为A（甲）、B（乙）和C（丙）三种类型[45-46]。甲型和乙型流感病毒的表面糖蛋白，包括HA 和NA 蛋白，是IFV 暴露最多的蛋白[46]。其中，甲型流感病毒是人类和动物最常见的病原体，可引起季节性流感。甲型流感病毒经常发生抗原变异，可以进一步分为H1N1、H3N2、H5N1、H7N9 等亚型（其中的H 和N 分别代表流感病毒的两种表面糖蛋白）[16]。IFV 的爆发有咳嗽、发烧和喉咙痛等症状，由于其高传染性，不仅在动物之间进行传播，同时在人群中也是常见的病原体与传染源。所以开发快速、高效的检测方法十分有必要。

S.Devarakonda 等[47]提出了一种高性价比的手工纸基电化学生物传感器，用于IFV H1N1 的无标记电化学检测，电化学生物传感器表现出良好的线性行为，检测限低至1.13×105pfu·L-1。Park 等[48]报道了一种由多功能DNA 四通接头（4WJ）和羧基二硫化钼（羧基-MoS2）杂化材料组成的电化学生物传感器，羧基-MoS2 提高了这种生物传感器的灵敏度，该电化学生物传感器对H1N1 显示出良好的线性响应，线性范围在100 nmol·L-1到10 pmol·L-1之间。J.Huang 等[49]设计了一种新型的由金纳米颗粒-石墨烯纳米复合材料（AuNPs-G）包裹的金电极组成的夹心式电化学生物传感器，采用纳米银-石墨烯（AgNPs-G）作为微量标记用于临床定量检测AIV H7。传感器的检测线性范围在1.6～1.6×104 ng·L-1，检测限低至1.6×103pg·L-1。

2.2 冠状病毒

冠状病毒的结构大致呈球形，突出部分呈冠状，直径约为125 nm，包膜直径为85 nm，冠状突长20 nm。冠状病毒是单链RNA 病毒，是已知RNA 病毒中基因组最大的病毒[50]。冠状病毒分布广泛，可感染脊椎动物（包括蝙蝠、猫、骆驼、猪等）和人类的呼吸、肠道、中枢神经系统等多个生物系统[51]。冠状病毒可以被细分为ɑ-冠状病毒、β-冠状病毒、γ-冠状病毒和δ-冠状病毒4 个属[52]，具体分类见表3。

表3 冠状病毒的分类Table 3 Classification of coronavirus

由SARS-CoV-2 引起的COVID-19 是自2019年12 月以来世界面临的一个严重的全球卫生威胁，COVID-19 已在几个月内将这一相对未被充分研究的病毒组转变为全球公共卫生事项[53-54]。由于抗病毒治疗仍处于早期阶段，因此SARS-CoV-2 的实验室诊断是及时管理和隔离确诊病例以防止进一步传播的关键[55]。

Büyüksünetçi Y T 等[56]建立了一种COVID-19 的电化学检测方法，传感器将血管紧张素转换酶2（ACE2）和CD147（结合S 蛋白的宿主特异性受体）固定在不同的金丝网印刷电极（AuSPE）上，用EDC/NHS 混合物进行修饰，在修饰的工作电极区加入SARS-CoV-2 S 蛋白，检查S 蛋白与ACE2 或CD147受体的结合。结果表明，ACE2 受体线性范围为7×105～1.5×106ng·L-1，检测限（LOD）为2.99×105ng·L-1；CD147 受体的线性范围为5×105～5×106ng·L-1，LOD值为3.9×104ng·L-1。B.Mojsoska 等[57]开发一种快速检测SARS-CoV-2 的无标签电化学生物传感器测定法。随着电化学生物传感器表面抗原浓度的增加，[Fe（CN）6]3-/4-电流的绝对变化被用来确定刺突蛋白的检测范围。该传感器能够检测到2×104μg·L-1以上的重组刺突蛋白亚基1 的特异性信号，而且能够检测到浓度为5.5×108pfu·L-1的SARS-CoV-2。这种新型电化学生物传感器的分析时间比RT-PCR 快得多，并且便于携带、操作简单，可实现现场诊断。

猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV）引起的一种猪接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水，该病毒的传播给人类造成了巨大的经济损失，及时检测显得尤为重要[58]。Ma J等[59]构建了一种用于检测PEDV 抗体的灵敏电化学发光（ECL）平台，该平台以AuNPs 修饰的石墨烯纳米片（Au-GN）为底物，以抗体-抗原反应为识别单元，并组装了级联Ru-DNA 纳米标签作为信号标记，生物传感器对PEDV 抗体表现出良好的分析性能，线性范围在100～5×106pg·L-1之间，检测限为50 pg·L-1（S/N=3）。

2.3 寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）

ZIKV 是黄病毒科病毒家族的一员，于1947 年首次在猴子身上发现，随后于1952 年在人类身上发现[60]。ZIKV 是一种约11 kb 且有包膜的二十面体正义单链RNA 病毒[61]，其是一种人畜共患病的节肢动物传播病毒（虫媒病毒）[62]，引起的临床症状与登革热和基孔肯雅病毒感染相似[63]。大量证据表明，ZIKV 与人类神经系统严重病变的病因有关，如新生儿小头畸形和成人格林-巴利综合征的发生。对于ZIKV，既无有效的治疗方法，也无有效的疫苗。因此，公共卫生应对措施主要侧重于预防感染，特别是孕妇感染，开发灵敏、快速的检测方法来识别ZIKV 相关的传染病十分有必要[64]。

Moco A C R 等[65]研发一种用电化学还原的氧化石墨烯和聚酪胺导电聚合物进行修饰的电化学基因传感器用于检测感染患者样本中ZIKV 的基因组RNA，检测限达100 fg·L-1，且具有良好的稳定性（60 d内）和快速分析（约20 min），填补了ZIKV 诊断方法的不足。Chompoonuch T 等[60]用表面印迹聚合物（SIP）和氧化石墨烯复合材料，研发出新型ZIKV 电化学生物传感器，检测限可达到RT-qPCR 检测水平。电化学生物传感器通过使用标准电化学技术测量电信号随缓冲液和血清中病毒浓度的变化来检测ZIKV，在PBS 中可检测浓度低至0.2 pfu·L-1，而在存在登革热病毒和培养基的情况下LOD 为20 pfu·L-1，实际样品中的最低检测限应为1 pfu·L-1，此LOD 值足以在实际应用中检测ZIKV。

2.4 猪瘟病毒（Swine fever virus）

非洲猪瘟病毒（ASFV）是非洲猪瘟（ASF）的病原体，是家猪和野猪的一种高死亡率致命疾病，自2018年在中国引入并迅速传播以来，几乎所有受ASFV 感染的猪死亡率接近100%。ASF 是由一种大型双链DNA 病毒ASFV 引起的，该病毒主要在巨噬细胞的细胞质中复制，自然宿主包括野生猪和鸟兽属节肢动物媒介[66-68]。ASFV 可通过口鼻或皮肤擦伤直接接触在受感染的猪之间传播。极高的病毒传播水平，特别是在血液中，为动物的直接或间接感染提供了大量病毒来源，病毒也存在于其他排泄物和分泌物中，包括尿液和唾液[68]。控制ASF 疫情的措施主要是及时发现和诊断。因此及早发现并控制ASF 疫情，建立灵敏、准确、快速的ASFV 早期检测方法是十分必要的。

Biagetti M 等[69]提出了一种基于DNA/LNA 探针与VP72 靶基因保守区互补配对的原则，建立了ASFV 电化学传感器检测方法，传感器利用带有锁核酸（LNA）代替的单链DNA 探针作为ASFV VP72 基因保守区的互补识别元件，可测出最低检出限为1.78×108copies·L-1基因组DNA，LOD 为2.45×108copies·L-1，单次测试时间仅需要5 min。该方法是一种很有前景的ASF 初步诊断筛查方法，具有相对快速、易于使用、成本低等主要优点。乐莉等[70]用量子点（QDs）和纳米金（AuNPs）构建了一种基于荧光共振能量转移的DNA 传感器，基于DNA 互补配对原则用于ASFV 特异性基因检测。传感器可在1.25 h 内快速检测ASFV 靶DNA，检测限为0.72 μmol·L-1，在猪肉、火腿肠和猪肉饺子等食品中的回收率为82.0%～108.0%，变异系数为0.02%～0.15%。

2.5 麻疹病毒（Measles virus，MeV）

麻疹，也称为红疹或莫比尔，是由MeV 引起的一种传染性疾病。MeV 是副粘病毒科的一种包膜病毒，是一种高度传染性负链RNA 病毒，直径为120～1 000 nm，人类是MeV 的自然宿主，主要通过呼吸道传播。麻疹以发热和皮疹为特征，通常伴有咳嗽、鼻炎和结膜炎，该病引起的症状看似无害，但麻疹的免疫抑制导致机会性感染的易感性增加，而机会性传染是每年10 万多人死亡的主要原因[71-74]。虽然PCR 技术是世界卫生组织推荐的方法，但一些实验室，特别是发展中国家的实验室，依赖于更简单的免疫学方法，需要数小时到数天的检测时间。因此，迫切需要一种快速、灵敏的方法来检测MeV，以防止疾病的迅速传播。

Mayall R M 等[75]研发一种电化学生物传感器快速检测MeV 的超灵敏方法，该传感器将对MeV 跨膜H 蛋白具有特异性的抗体通过N-杂环卡宾（NHC）的自组装连接到Au 电极，所得电化学生物传感器对104～105μg·L-1麻疹病毒具有线性响应，检测限为6×103μg·L-1，检测时间需要大约15 min，每次测试成本仅为3.72 美元，这种方法预计将对麻疹监测产生重大影响，并可推广到其他病毒，包括SARS-CoV-2。Philani M 等[76]构建了电化学阻抗免疫传感器，使用麻疹抗原修饰的金电极表面作为传感界面来检测麻疹特异性抗体。结果表明：当抗体浓度为1 000 μg·L-1时，40 min 后电极达到最佳条件，也证实了基于阻抗的无标记免疫传感器在麻疹检测中显示出良好的应用前景。

3 总结

病毒感染是导致人类与动物患病的主要原因之一，严重威胁着人类与动物的健康和安全，同时也造成了巨大的经济损失。为了保证人类的生命安全和财产安全，及时发现与诊断病毒十分重要。电化学生物传感器是用生物活性材料（酶、蛋白质、DNA、抗体、抗原等）与化学换能器有机结合的一门新兴交叉学科，是生物技术发展过程中必不可少的一种检测与监控方法，同时也是一种快速、微量分析方法，未来势必会成为一种发展趋势。传统的检测方法虽然应用广泛且特异性强，但存在需要专业技术人员和费用较高等缺陷。电化学生物传感器具有构造简单方便、用时较短、检测结果灵敏、不需要专业技术人员等多重特点，是理想的病毒检测平台，在动物和人类健康监测方面具有广阔的应用前景。目前，电化学生物传感器在高传染性病毒检测应用中引起了广泛关注。尽管电化学生物传感器在病毒检测中显示出特有的优势，但是微型化和可移动化检测技术仍然备受关注，未来将移动智能手机与电化学生物传感器相结合势必是种发展趋势，该技术必将在高传染性病毒检测方面得到更广泛的应用，尤其适用于许多贫困地区的健康监测。