三种牛虻的形态学及分子生物学鉴定

刘明月，孙健，鞠皓，常巧呈，3

（1.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，大庆 163319；2.通化市东昌区动物疫病预防控制中心，3.汕头大学）

虻科昆虫俗称“牛虻”，“瞎虻”，隶属于昆虫纲双翅目短尾亚目虻科，共144 属约4 455 种，其中虻属约1 300 种[1-5]；虻类不仅叮咬、吸血、骚扰人畜引起皮肤损伤或荨麻疹样皮炎，导致牲畜体重下降；还作为重要的生物传播媒介，传播多种人畜共患疾病，如土拉弗氏菌病、炭疽和罗阿丝虫病等，不同种类的牛虻可传播不同的疾病，给畜牧业和公共卫生安全带来危害[6-14]。

寄生虫的准确鉴定是寄生虫防控和科学研究的基础，当前虻的鉴定主要依靠形态学鉴定。虻类的鉴定主要依赖于传统的形态学方法，即：头部基胛和触角的形状；背板和翅膀的花纹等。而形态学鉴定需要形态学鉴定专家。现在文献中大部分只是文字的描述，缺少相关形态学图片数据。分子生物学鉴定在寄生虫鉴定中具有一定的优势，但虻类有关的基因数据相对较少，使鉴定困难。分子生物学方法主要依据线粒体或核糖体序列等分子marker[15-16]。对于GenBank中缺乏序列信息的虻种鉴定以及新虻种的发现，尚离不开形态学鉴定方法。分子技术在研究虻类种群动态时可作为提供重要信息强有力的工具，线粒体（mt）细胞色素c 氧化酶亚基1（COX 1）基因序列因其较为保守，种内遗传差异小等特点被认为是区分不同节肢动物物种的标准方法[17-20]。可用作虻类种属鉴别的分子遗传学标志。结合分子的鉴定方法（DNA 条形码方法）可以减少仅使用形态特征的局限性。用PCR 方法扩增其COX 1 序列并与GeenBank 上已有的相关虻科序列进行比对分析和进化分析对虻的鉴定具有重要意义。因此，研究拟综合应用形态学鉴定和分子鉴定两种方法对采集到的虻进行鉴定。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 虫体来源

虫体采来自黑龙江省大庆市，采集方法为挥网法。

1.1.2 实验材料

昆虫针，泡沫板，体视镜，移液管，研磨钵，镊子，挑针，DNA 提取试剂盒（TIANamp Genomic DNA Kit），ExTaq DNA 聚合酶（TaKaRa），dNTPs（TaKa-Ra），pMD18-T 载体（TaKaRa），大肠杆菌DH5α 感受态细胞（TaKaRa），DNA Marker（2000），1×TAE，蛋白酶K，生理盐水，75%乙醇，琼脂糖，溴化乙锭，DNA凝胶回收试剂盒（AxyPrep DNAGel Extraction Kit），甘油，冰乙酸，去离子水等实验常规试剂。

1.2 实验方法

1.2.1 形态学观察

将牛虻用昆虫针保定在泡沫板上，用相机拍摄局部特征；随后在体视镜下进行观察。依据虫体大小和外部形态，初步判断是三种牛虻，分别命名为牛虻A、牛虻B 和牛虻C。不断调整体视镜倍数和虫体的位置来观察虫体外观及各部位器官的形态特征[21-24]。

1.2.2 总DNA 提取

将虫体用生理盐水反复清洗三次后，再将部分组织放入研磨钵加入液氮充分研磨，消化后用TIANamp Genomic DNAKit（TIANGEN）试剂盒严格按照说明书进行DNA 提取，提取后将DNA 分装置于-20 ℃冰箱中保存，用于下一步PCR 扩增。

1.2.3 目的基因的扩增

通过NCBI 上已有虻科的序列运用primer Premier 5 设计COX 1 引物，上游引物为：5′-ATT CAA CCA ATC ATA AAG ATA TTG G-3′，下游引物为：5′-TAA ACT TCT GGA TGT CCA AAA AAT CA-3′。引物由吉林库美生物有限公司合成。以这三种虫体DNA 为模板，PCR 扩增虫体COX 1 序列，反应体系为25 μL，其中18.3 μL 蒸馏水，2.5 μL 10× Ex Taq buffffer，2 μL dNTP mixture，上下引物各0.5 μL，1 μL DNA 模板和0.2 μL Ex Taq DNA 酶。将PCR 反应混合物装在PCR 管中，放入Takara TP600 扩增仪（日本TKAKRA）中，采用以下扩增条件：94 ℃5 min（预变性），94 ℃30 s（变性），40 ℃1 min（退火），72 ℃1 min（延伸）35 个循环，最后72 ℃延伸10 min。将扩增出的产物通过琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照。切下目的条带后用DNA 琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。然后将回收的DNA 产物连接到pMD18-T 载体上，经过无抗LB 培养后，涂在带有AMP+的固体LB 培养基上，最后将克隆所得阳性质粒送到吉林库美生物有限公司，使用相同的引物进行双向测序。

1.2.4 序列分析与进化关系分析

测序得到的序列，应用DNAStar 软件中的MegAlign 与虻科的相关虫体进行同源性分析。利用MEGA X 软件，基于COX 1 序列，以以舞虻科Rhamphomyia insignis为外群，采用最大简约法（Maximum Parsimony，MP）将本研究的三种牛虻与虻科4 属20种牛虻构建进化树，探讨这三种牛虻与其它属牛虻之间的亲缘关系。

2 结果与分析

2.1 虫体形态学观察

牛虻A：初步判断为雁虻，雌性体长20～25 mm。胸部背板黑灰色，无纵纹；腹部背板黑色且中间有1列灰白色三角，第1～3 背板两侧具棕红色斑；后缘具浅黄色横带。复眼无带；额灰色，覆黑毛，额顶宽略大于基宽，额高为基宽的4.5 倍；亚胛覆粉；触角柄节和梗节棕色，鞭节基部红棕色，端部及端环节棕黑色；下颚须棕色，第2 节长为基宽的4 倍；平衡棒棕黑色，球部顶端棕色。腹板黑灰色，第1～4 腹板棕色，中央具1 列圆形黑斑。是我国东北、华北山区常见种也是攻击牲畜的重要种类（图1ABC）。

图1 牛虻形态学观察Fig.1 The morphological observation of Gadflies

牛虻B：初步判断为广斑虻，体黄色，雌性体长9～10 mm；触角梗节长为宽的2 倍；腹部背板具4 列长三角形黑斑。头部略宽于胸部，复眼裸，头顶具3个棕黑色单眼，位于灰黑色单眼瘤区内，单眼瘤区小，覆粉，两侧远离复眼，着生棕色毛；额高大于基部宽度，顶宽略窄于基宽，棕黄色，着生稀疏的棕色毛；额基胛棕色，两侧与眼分离；口毛棕色。触角短，棕色，着生黑毛，下颚须黄棕色，着生棕色毛。喙长，为下颚须长的1.5 倍，棕黑色，唇瓣黑棕色，着生黑毛。胸部：盾片黄棕色，着生棕色短毛，中央有1 窄的且两侧有1 对宽的棕黑色纵条，侧板棕黄色，着生棕色毛，有翅端斑。腋瓣烟棕黑色，具棕色缨毛。平衡棒柄棕色，球部暗棕色。足黄棕色，着生棕色毛，前足胫节及各足跗节色较暗，富黑毛。腹部：黄棕色，着生棕色毛，背板具4 列长三角形黑斑，各背板侧缘黑色，浅色部分着生棕色毛，黑色部分着生黑毛。腹板黄棕色，着生黄棕色毛。分布于黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、北京等地。是稻作区的主要吸血虻种（图1DEF）。

牛虻C：初步判断为土耳其麻虻，雌性体长8～10 mm，灰色，翅长7～8 mm。腹部背板黑棕色，中央具不明显纵浅条，第2～6 背板两侧具大的圆灰白斑，各背板具浅色后缘。头部：额两侧平行，基部宽度大于高，基胛黑色，宽为高的4～5 倍，两侧与复眼分离，侧点与基胛和复眼均分离，中央点小；在触角间具黑色绒斑，口毛白色。触角柄节黑色，覆灰粉，着生白毛，长约为宽的3 倍，端部背面具凹陷，梗节背突小，灰色，具黑毛，鞭节的基环节黄棕色，有时端部黑色，略长于柄节，端部3 个环节黑色。下颚须浅灰白色，主要着生白毛。胸部：盾片黑色，中纵条窄。侧板和足基节棕灰黑色，具灰棕色毛。基部白色，中、后足胫节黑色，具2 个棕黄色环，跗节黑色。翅膀具有玫瑰型花斑，翅透明。平衡棒浅黄棕色。腹板灰色，着生灰白色毛，具浅色后缘（图1GHI）。

2.2 目的基因的扩增

成功扩增三种牛虻的COX 1 序列，分别在1 500 bp左右出现明亮且单一条带，与目的基因大小相似（图2）。

图2 三种牛虻COX 1 扩增结果图Fig.2 The COX 1 amplification results of three gadflies

图3 基于COX 1 序列构建的系统发育树Fig.3 The phylogenetic tree based on COX 1 sequences

2.3 序列分析与进化分析

将阳性质粒送至吉林库美生物有限公司进行测序，拼接后得到长度分别为1 506 bp、1 500 bp 和1 506 bp 的COX 1 序列。牛虻A 的A+T 含量为69.85%，经MegAlign 同源性序列分析比较发现，虫体与GenBank 上已经发表的Tabanus chrysurus（NC 062705.1）的同源性最高为96.5%。牛虻B 的A+T 含量为69.00% ，与Chrysops niger（NC 067608.1）的同源性最高为90.1%；牛虻C 的A+T 含量为68.26%。与Haematopota pluvialis（MT 584146.1）的同源性最高为91.1%。基于COX 1 序列，与虻科4 属20 种牛虻构建的进化树显示，虻科四属牛虻形成三个大的分支，第一个大的分支为黄虻属；第二个大的分支又包括两个小的分支，分别是麻虻属与虻属；第三个大的分支为斑虻属。牛虻A 与虻属聚集在一起，与金色虻处于同一分支中亲缘关系较近；牛虻B 与斑虻属聚集在一起，与Chrysops distinctipennis和Chrysops dispar处于同一分支中亲缘关系较近；牛虻C 与麻虻属聚集在一起，与Haematopota sp.处于同一分支中亲缘关系较近。因此鉴定牛虻A 为虻属；牛虻B 为斑虻属；牛虻C 为麻虻属。

结合形态学鉴定牛虻A 为雁虻，牛虻B 为广斑虻，牛虻C 为土耳其麻虻。

3 讨论

虻类对所有节肢动物的侵袭都会造成动物的烦扰不安，动物为了躲避也会造成能量的损耗。当成年虻特别多时，放牧家畜可受到连续不断的疯狂攻击，可能消耗大量时间和精力去抵御这种袭击，以至无法充分休息或采食，最终家畜出现疲惫，影响生产力，有时出现死亡。家畜对牛虻特别惧怕，叮咬时，虻的上腭和下腭划破血管，用唇舔食从伤口流出的血液，造成剧烈疼痛。对奶牛乳房和乳沟等皮肤皱褶处的反复攻击可导致广泛的渗出性湿疹病变，还可能继发细菌感染[25]。

成年虻在饱血之前如被宿主赶走，很快会飞到第二个宿主身，上完成吸血，这样伤口就会受到机械性传播的细菌（如炭疽）、病毒（如马传染性贫血病毒）等污染。每个虻都吸入大量的血液（高达虻重量的4 倍），弥补了血液中低浓度微生物在中间宿主体内不能繁殖的缺陷，也提高了虻作为机械性传播媒介的有效性。有些哺乳动物的锥虫（血鞭毛虫）也可通过虻机械性或生物性传播。在亚洲，马、骆驼、大象和犬的一种致死性疾病即苏拉病（伊氏锥虫）可通过虻机械性传播。泰勒锥虫必须在虻的体内繁殖，因为它在家畜的血液中非常稀少，通常必须通过培养才能证明它的存在。据报道，寄生在糜鹿、绵羊体内的施氏血管线虫，从血液中的微丝蚴发育到感染性第三期幼虫都是在虻体内完成的[26-27]。

虻科昆虫种类多、分布广，世界已知3 亚科137属约4 300 种，中国虻科最早在20 世纪40 年代文献记载有4 属68 种，自20 世纪60 年代以后我国虻科研究有了明显进展，至20 世纪90 年代我国的虻科记载有11 属418 种0 至今，我国的虻科昆虫经统计有14 属454 种。我国东北三省虻科昆虫研究起步较晚，自20 世纪80 年代以后才有明显的研究进展，黑龙江虻类采集记述采自该省的虻类5 属37 种[28-29]。我国虻科区系调查工作虽已取得很大成绩，种数已达世界已知种数的十分之一，但要彻底搞清中国的虻科区系还有一段距离。由于目前虻相关的分类研究资料和数据还相对较少，许多种类的牛虻序列Geenbank 中还没有，研究首次扩增了三种牛虻的cox1 序列，并上传GeenBank，与相关序列比较分析，并构建了分子进化树。基于COX 1 序列构建的进化树显示，牛虻A 与虻属聚集在一起，与金色虻（Tabanus chrysurus）处于同一分支中亲缘关系较近；牛虻B 与斑虻属聚集在一起，与Chrysops distinctipennis和Chrysops dispar处于同一分支中亲缘关系较近；牛虻C 与麻虻属聚集在一起，与Haematopota sp.处于同一分支中亲缘关系较近。因此鉴定牛虻A 为虻属；牛虻B 为斑虻属；牛虻C 为麻虻属。结合形态学鉴定牛虻A 为雁虻，牛虻B 为广斑虻，牛虻C 为土耳其麻虻。填补虻科基因组数据库，为探究虻科分类以及与其他虻科亲缘关系提供依据。

在虻种群集中活跃的林区、农业区采取必要的防护措施，如戴防护帽、涂抹驱避剂等。牧区可选择在清晨或夜间放牧，以避开虻种群活动高峰期。在虻害严重的居民生活区周围，注意疏通渠道、填平沟洼及清除杂草，以减少虻孳生和产卵场所。在畜舍周围的树木、草丛和栅栏等虻种群栖息地，适时适量地喷施杀螟松、溴氰菊酯和三氯杀虫酯等药物进行防治[30]。虻和斑虻很难被彻底杀死或驱除，最好的措施是在虻活动的高峰期将家畜关在有防护措施的圈舍内。

4 结论

经形态学及分子生物学鉴定了大庆地区的三种牛虻，并描述了其种类的形态特征。雁虻体形最大约为23 mm，广斑虻和土耳其麻虻体形最小约10 mm。研究鉴定的三种牛虻体色具有明显差异，雁虻的体色为棕黑色，是虻类里体形最大的。广斑虻体色为黄色，翅膀的花纹是斑虻属独有的。土耳其麻虻体色为灰色，翅膀透明且具有玫瑰型花斑是麻虻属独有的特征。考虑到牛虻种类的繁多，研究提供的大庆地区牛虻种类鉴定是有限的。因此，为了更好地了解牛虻的多样性、流行率、在疾病传播中的作用及牛虻携带的病原体等，有必要进行进一步的采集鉴定。为后续深入研究奠定基础，同时这将促进对牛虻这一被忽视的媒介采取更有效的防控措施。