微生物合成纳米硒-环境持久性自由基的评估

吴 兰,仝泽方,贾汉忠,马英辉,卢美欢,李利军

(1. 陕西省微生物研究所,西安 710043;2. 西北农林科技大学 资源环境学院,陕西杨凌 712100)

硒是生物体生长所必需的微量元素,在动物体内发挥着重要的生理功能。与无机硒和有机硒相比,纳米硒属无定型单质硒,由于其吸收率高、毒性低、生物活性高的特点被广泛应用于动植物生产、医药及保健领域[1-7]。目前,国内外研究报道集中于纳米硒的制备方法以及生物学功能和应用方面。纳米硒的合成方法有化学法与生物转化法,化学纳米硒的合成方法主要有载体模板法[8-9]、溶胶法[10]、固相法[11]。然而,工业产生的纳米硒成本较高、副产品有毒。微生物法转化合成的纳米硒低毒、稳定、高效,呈规则的球状,性能优于化学合成的纳米硒[12]。目前,许多微生物可以将硒酸盐或亚硒酸盐还原成纳米硒,如蜡样芽孢杆菌[13]、地衣芽孢杆菌[14]、分支杆菌[15]等,通过SEM电子扫描电镜光谱分析,发现其菌体周围分散着大量纳米硒颗粒,且颗粒呈规则的球形,通过分离纯化技术可将菌体与纳米硒颗粒分离以得到纯净的纳米硒颗粒。

1 材料与方法

1.1 化学药剂

酵母提取物,北京奥博兴生物技术有限公司。尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、正辛醇和无水乙醇,天津天力化学试剂有限公司。葡萄糖、蔗糖,天津科密欧化学试剂有限公司。亚硒酸钠,国药集团。5,5-二甲基-1-吡咯烷N-氧化物(DMPO,97%)、二甲基亚砜,国家化学试剂有限公司(中国上海)。

DHZ-D恒温摇床,苏州培英测试设备有限公司。HC-3018R高速离心机,安徽中科众佳科学仪器有限公司。96Ⅱ超声波细胞破碎仪,西安必朗生物技术有限公司。扫描电子显微镜,日本电子有限公司(Hitachi S-3400N)。电子顺磁共振波谱仪(EPR),EMXmicro-6 /1 / P / L,德国。

1.2 微生物对纳米硒的合成

解淀粉芽孢杆菌Lxz-41于2016年分离自陕西省安康市紫阳县富硒土壤,并于2016-10-18将该菌株保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏号为 CCTCC M2016578。将保藏的菌株接入固体斜面LB培养基,30 ℃静置活化24 h,而后接至液体种子培养基(葡萄糖2%,酵母粉0.5%,氯化钠0.5%,pH自然),30 ℃、180 r/min摇床培养12 h后按1%接种到纳米硒合成培养基中(蔗糖4.5%,尿素0.1%,酵母粉1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.1%,氯化钠0.5%,亚硒酸钠0.15%,初始pH为7.0), 40 ℃、160 r/min 培养18 h,然后4 ℃、6 000 r/min 离心10 min,取沉淀用无菌生理盐水冲洗3次,沉淀-20 ℃冷冻保存,备用,同时取未加硒的沉淀作为对照。以上试验均重复3次。

1.3 硒纳米粒子的纯化及表征

将上步获得的沉淀,用无菌蒸馏水进行悬浮,进行冰浴超声破壁(150 W,超声10 s,间歇5 s)20次,获得菌体裂解液,10 000 r/min 4 ℃冷冻离心10 min,沉淀用无菌去离子水清洗3次,并悬浮,加入同体积氯仿萃取30 min(4 ℃),重复2～3次,合并下层萃液,依次用100%、70%、30%、生理盐水清洗,然后用混悬仪均匀悬浮,-20 ℃预冻24 h后,冻干后即为纯化纳米硒粉末。

将纯化后的纳米硒颗粒用无水乙醇悬浮,然后吸取一滴滴于硅片上,待乙醇自然挥发后可用于电子扫描电镜检测。同时取未纯化的带硒菌体、正常菌体进行对照检测。

1.4 自由基测量

为了进行不同样品的EPR分析,将20 mg固体样品放入高纯度石英EPR管中,并在室温下进行分析。为了检测潜在的ROS形成,将200 μL新鲜制备的DMPO(0.1 mmo/L)的水或二甲基亚砜溶液添加到1.5 mL离心管中,并添加10 mg固体样品。然后使悬浮液通过0.45 μm注射器过滤器(Whatman,Dassel,德国)以从溶液中分离硒颗粒。将滤液转移到EPR毛细管中,并在一端用真空油脂密封。将毛细管放入EPR管中并固定在EPR谐振器中。仪器和操作参数如下:中心场,3515 G;微波频率9.7 GHz;微波功率,2.0 mW;调制频率,4.0 G;扫描宽度200 G;接收机增益3.54×104,时间常数41.0 ms;扫描时间80.0 s;10次扫描。

2 结果与分析

2.1 硒纳米颗粒的表征

通过SEM观察硒纳米颗粒(SeNPs)的形貌特征。如图1-a所示,由细菌转化产生的硒纳米颗粒的尺寸小于300 nm。分离纯化后产生的硒纳米颗粒尺寸均匀,纯度高,且大部分杂质被分离出来。图1-b显示了带有硒纳米颗粒的菌体(bacteria-SeNPs),可以看出纳米硒颗粒由菌体外泌后部分分散沉淀在菌体表面。图1-c显示了无硒存在下细菌的微观形态。细菌通过离心冷冻干燥后,它们以叠层状态出现,且表面没有纳米硒。

图1 纯化纳米硒(a)、带菌体纳米硒(b)和菌体(c)的扫描电镜图片Fig.1 SEM of Se-NPS (a),bacteria with SeNPS and bacteria

2.2 细菌转化的纳米硒体系中的形成

GSH.谷胱甘肽;GR.谷胱甘肽还原酶;TR.硫氧还蛋白还原酶GSH.Glutathione;GR.Glutathione reductase;TR.Thioredoxin reductase图2 解淀粉芽孢杆菌Lxz-41转化纳米硒的反应机理Fig.1 Reaction mechanism of conversion of nanometer selenium by Bacillus amyloliquefaciens LXZ-41

图3 不同样品中活性氧自由基EPR谱图Fig.3 EPR image of ROS in different samples

2.3 持久性自由基(PFRs)在细菌转化的SeNPs中产生

使用EPR分别检测SeNPs(1),带纳米硒菌体(2)和对照菌体(3)中PFRs的信号。如图4所示,在对照细菌(3)和SeNPs(1)中检测到PFRs信号,而在SeNPs-细菌(2)中未检测到PFRs信号。SeNPs有很好的生物相容性,在纳米硒转化过程中所用的培养液一般含有蛋白质或含有O、N、S的生物分子,如糖、氨基酸等。通过分离提纯沉降得到SeNPs粉。生成的SeNPs通常以SeNPs-surf的形式存在,具有特定的粒径和特殊的形貌[24-25]。在SeNPs转化的微环境中,SeNPs与修饰剂之间不是简单的物理吸附结合,而是在界面通过化学键牢固地结合在一起[26-28]。主要原因是纳米硒由于其高的反应活性,当遇到具有能够产生化学反应的活性作用基团的小分子和生物大分子时,可形成一定数量的化学键,与许多小分子以及生物大分子都能配位结合。这种SeNPs与生物分子之间的电子交换作用促进生物分子的电子转移[29],因此,表面的电子转移可能会产生孤对电子,这可能就是细菌转化生成的SeNPs-surf上检测到EPFRs的主要原因。同时,这种界面配位作用和界面两相间的化学反应增强了SeNPs体系的稳定性,使其可在环境中长久存在。

图4 不同样品中环境持久性自由基的EPR图谱Fig.4 EPR image of PFRs in different samples

具已有报道,SeNPs具有良好的抗氧化活性,主要原因与其表面修饰剂有关。他们认为SeNPs是以SeNPs-surf形态参与清除自由基反应,这表明SeNPs与修饰剂之间以及SeNPs-surf与自由基之间均发生了相互作用,而SeNPs-surf的抗氧化作用实际上是表面修饰粒子所发生的界面化学反应[27-28,30-31]。从本试验结果中得出细菌转化后生成的SeNPs-surf上带有PFRs,因此,是否所有细菌转化生成的SeNPs都带有PFRs,其EPFRs的形成机制是什么,它是否参与到纳米硒生物活性,成为一个新的研究课题。因此,运用界面化学的原理技术及自由基检测技术开展SeNPs与表面修饰剂之间以及SeNPs-surf与外部离子、分子和其他个体之间相互作用的研究,有可能在分子水平上理解SeNPs的生物活性并揭示SeNPs与自由基、蛋白质和DNA作用机制。

3 结论与讨论

本试验研究了细菌转化的纳米硒的物理化学性状。结合电镜发现细菌-解淀粉芽孢杆菌Lxz-41可高效转化NaSeO3为纳米硒颗粒。同时发现在纳米硒转化过程中,EPFRs作为一种新型物质在纳米硒表面有弱表现。该结论为细菌转化纳米硒及其转化过程中的产物提供了更多的信息。同时,所得结果为了解微生物转化无机硒的表面微观结构变化提供了新的思路。