藏绵羊不同部位骨骼肌营养成分、肌纤维特性及与相关基因表达的关联分析

赵 丽,沈继源,包高良,赵鹏飞,石斌刚,刘 秀,李少斌,罗玉柱

甘肃农业大学 动物科学技术学院/甘肃省草食动物生物技术重点实验室,兰州 730070)

中国是羊肉生产大国,也是消费大国。随着消费者生活水平的提高,人们对羊肉品质的要求也不断提高,生产高档羊肉成为产业发展的必然趋势。肌肉营养成分是衡量肌肉品质的重要指标[1]。肌纤维直径、密度及横截面积等指标反映肌纤维特性,也直接影响动物的产肉潜力及肌肉嫩度等肉品质指标[2]。骨骼肌占动物体的40%,其主要由大量的肌纤维组成。成年动物的骨骼肌生长以肌肉蛋白质合成主导的骨骼肌肥大为主,主要体现在肌纤维直径和横截面积的增加。不同部位肌肉会因运动量的差异导致肌纤维呈不同程度的肥大,同时也会导致肌内脂肪(Intramuscular fat,IMF)沉积量的差异,进而影响肉的品质[3]。

动物骨骼肌肥大和肌内脂肪沉积受大量功能基因及信号通路的调控,其中AKT-mTOR信号通路是调控骨骼肌肥大的主要信号通路。有研究发现,骨骼肌细胞内Wnt7a通过其受体激活AKT-mTOR信号通路,从而促进肌管分化和肌纤维肥大[4]。从晓霞[5]研究发现,抑制AKT或mTOR会降低蛋白的合成,削弱骨骼肌再生修复能力,导致肌腱中胶原纤维直径变小。Sandri 等[6]研究发现,AKT具有调节肌肉蛋白质合成代谢的功能,在敲除AKT1和AKT2鼠模型中可见明显的肌肉萎缩。AKT1是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)的一种亚型[7],它可以通过磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)调控细胞生长、蛋白质合成等多种代谢过程[8]。 mTOR通过磷酸化下游的效应蛋白p70S6K和4E-BP1,从而调控骨骼肌的生长发育[9]。Bodine等[10-11]通过应用mTOR抑制剂干预SD大鼠动物模型发现,mTOR以及其下游的目标蛋白参与骨骼肌肥大过程。以往的大量研究证实AKT1、mTOR参与调控蛋白质代谢过程[5,12]。脂肪酸结合蛋白3 (FABP3)是结合脂肪酸的FABP家族成员之一,主要表达于成熟心肌细胞和骨骼肌。已有研究证明,FABP3参与肌肉中脂肪酸转运和脂肪沉积[13-14],其正调控肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)沉积量[15-16],进而影响肌肉嫩度和多汁性[17]。关于AKT-mTOR信号通路调控骨骼肌肥大的研究目前主要集中在人及啮齿类动物上,在藏绵羊上的研究尚未见报道。同时关于FABP3基因调控绵羊不同部位肌肉脂肪沉积的研究也未见报道。

本试验以3岁藏绵羊为研究对象,比较7个部位肌肉组织中的肌肉营养成分及肌纤维特性,分析AKT1、mTOR和FABP3基因在7个肌肉部位的表达量差异。同时分析不同部位肌肉营养成分和肌纤维特性与AKT1、mTOR和FABP3基因表达的相关性,以期为藏绵羊肌肉发育及肉品质的研究提供理论基础,同时也为藏绵羊种质资源的科学利用与发展提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选取青海省海晏县自然放牧条件下,生长发育正常的3岁成年藏绵羊母羊3只,屠宰后分别采集臂三头肌(Triceps brachii)、冈上肌(Supraspinatus)、股四头肌(Quadriceps femoris,)、背最长肌(longissimus dorsi)、腰大肌(Psoas major)、胸斜方肌(Trapezius thoracalis)和小腿肌(Leg muscle)的肌肉组织各3个重复分别置于冰盒和液氮中,用于肌肉营养成分测定和总RNA的提取。同时采集长宽厚为3 cm×2 cm×1 cm大小的以上各部位肌肉组织各3份,置于4%多聚甲醛固定液中,用于后续苏木精-伊红H&E染色。

1.2 试验方法

1.2.1 肌肉营养成分分析 将冷冻肌肉样品在室温解冻后进行营养品质的测定。肌肉水分含量、粗蛋白含量及肌内脂肪(IMF)含量分别按国标GB/T 9695.15-2008、GB/T 5009.15-2016 和GB/T14772-1993方法进行测定。

1.2.2 肌纤维特征分析 分别取出置于4%多聚甲醛固定液中的待测组织块,修剪为长宽厚为0.5 cm×0.2 cm×0.2 cm的组织块,按照常规的石蜡切片方法进行脱水、包埋、切片、H&E染色、封片,最后镜检合格的样片在尼康生物显微镜 Ci-L(日本)荧光成像系统进行拍照。使用Image-pro plus 6.0分析软件,分别测量200倍照片中每个视野内的肌纤维数量、总面积以及视野面积,并计算出单个平均面积以及肌纤维密度,每张切片选取5个大小均一的肌纤维,测量肌纤维直径。

1.2.3 RNA 提取与 cDNA 合成 按照Trizol试剂盒(Ambion)说明书进行肌肉组织总RNA的提取,通过NanoDrop One超微量紫外分光光度计(Thermo,美国)检测总 RNA 浓度和纯度后,用Evo M-MLV反转录试剂盒(艾科瑞生物,湖南,中国)将 RNA 反转录为cDNA。反转录的 cDNA 置于-20 ℃保存,用于检测相关基因的表达量。

1.2.4 引物设计与合成 参考NCBI上绵羊AKT1、mTOR、FABP3基因的序列信息,以β-actin为内参基因,用 Primer v 5.0 软件(Premier Biosoft International,Germany)设计引物(表 1),引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司(北京,中国)合成。

表1 AKT1、 mTOR、 FABP3基因引物序列Table 1 Primer sequence of AKT1, mTOR and FABP3 gene

1.2.5 实时荧光定量PCR 根据ChamQ Universal SYBR Green PCR 试剂盒(Q711002/03,Vazyme)说明书,使用实时荧光定量PCR技术检测肌肉发育相关基因在7个部位肌肉组织中的相对表达量。反应体系的总体积为20 μL,整个反应过程在Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex 实时PCR仪(Thermo Fisher Scientific,MA,USA)上进行,反应条件为:95 ℃预变性 30 s;95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸 30 s(共40个循环)。每类样品各做3个生物学重复和3个技术重复。

1.3 数据分析

采用Excel 2010整理数据,用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析、双变量简单相关进行Pearson相关系数计算以及差异显著性检验;多重比较采用Duncan氏法,结果以“平均值±标准差”表示。使用2-△△Ct法计算基因的相对表达量,用GraphPad Prism 5软件制图。

2 结果与分析

2.1 藏绵羊不同部位肌肉的营养成分比较

由表2可知,藏绵羊不同部位肌肉水分含量无显著差异(P>0.05)。小腿肌蛋白含量显著高于臂三头肌、腰大肌和胸斜方肌(P<0.05),与背最长肌、股四头肌及冈上肌无显著差异(P> 0.05)。背最长肌中肌内脂肪含量最高,与腰大肌肌内脂肪含量无显著差异(P>0.05),小腿肌中肌内脂肪含量显著低于其他部位(P<0.05)。

表2 藏绵羊不同部位肌肉营养成分Table 2 Nutritional composition of different parts of muscle in Tibetan sheep %

2.2 藏绵羊不同部位肌肉的肌纤维特性比较

肌纤维特性分析结果表明(图1,表3),藏绵羊不同部位肌肉组织的肌纤维横截面积大小为冈上肌>股四头肌>臂三头肌>小腿肌>胸斜方肌>腰大肌>背最长肌,其中背最长肌的肌纤维横截面积最小,且显著低于其他各部位(P<0.05);不同部位肌肉组织的肌纤维直径大小为股四头肌>冈上肌>小腿肌>臂三头肌>腰大肌>胸斜方肌>背最长肌,各部位肌肉的肌纤维直径大小差异不显著(P>0.05);不同部位肌肉组织的肌纤维密度大小为背最长肌>腰大肌>胸斜方肌>臂三头肌>小腿肌>股四头肌>冈上肌,其中背最长肌的肌纤维密度显著大于冈上肌(P<0.05)。综上,藏绵羊背最长肌的肌纤维横截面积和肌纤维直径最小,而肌纤维密度最大。

A.臂三头肌 B.冈上肌 C.股四头肌 D.背最长肌 E.腰大肌 F.胸斜方肌 G.小腿肌A.Arm triceps; B.Supraspinatus; C.Quadriceps femoris; D.Longissimus dorsi; E.Psoas major ; F.Trapezius thoracalis; G.Calf muscle图1 肌纤维的H&E染色Fig.1 H&E staining of muscle fibers

表3 藏绵羊不同部位肌肉的肌纤维比较Table 3 Comparison of muscle fibers in different muscles of Tibetan sheep

2.3 藏绵羊不同部位肌肉中产肉性能相关基因表达量比较

利用实时荧光定量PCR技术检测与肌肉生长发育相关的AKT1、mTOR基因及与肌内脂肪沉积相关的FABP3基因在臂三头肌、冈上肌、股四头肌、背最长肌、腰大肌、胸斜方肌和小腿肌中的相对表达量(图2)。结果显示,小腿肌中AKT1的表达量最高,且显著高于其他各部位肌肉组织(P<0.05),腰大肌中AKT1的相对表达量最低;股四头肌中mTOR的相对表达量最高,其次是背最长肌和小腿肌(P>0.05),胸斜方肌中mTOR的相对表达量低于股四头肌和小腿肌(P<0.05);背最长肌中FABP3的相对表达量高于冈上肌、胸斜方肌及小腿肌(P<0.05),而与臂三头肌、股四头肌及腰大肌差异不显著(P>0.05)。

The relative expression level of the gene in the arm triceps is set to 1.The same lowercase letters indicate insignificant differences (P>0.05),and different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05)图2 藏绵羊不同部位肌肉组织 AKT1、 mTOR、 FABP3基因的相对表达量Fig.2 Relative expression levels of AKT1, mTOR and FABP3 genes in different parts of muscle tissue in Tibetan sheep

2.4 藏绵羊肌肉中各指标间的相关性

由表4可知,藏绵羊肌肉中蛋白、肌内脂肪含量均与水分含量呈负相关;肌纤维面积、直径与肌内脂肪均呈负相关,而肌纤维密度与肌内脂肪呈正相关;肌纤维面积与肌纤维直径之间呈极显著正相关(r=0.842,P<0.01),而与肌纤维密度呈极显著负相关(r=-0.906、-0.831,P<0.01);基因AKT1和mTOR与蛋白含量均呈正相关,其中AKT1与蛋白含量呈极显著正相关(r= 0.601,P<0.01);此外,基因AKT1与肌内脂肪含量呈显著负相关(r=-0.496,P<0.05),mTOR与肌内脂肪含量呈正相关(r=0.038,P>0.05);FABP3基因与肌内脂肪含量呈极显著正相关 (r=0.728,P<0.01)。

表4 各指标之间的相关性分析(双尾检验,N=21)Table 4 Correlation analysis between indicators (two-tailed test,N=21)

3 讨 论

肌肉营养成分对肉的口感、嫩度和风味等肉品质指标具有重要意义[18]。肌肉中的水分含量直接影响肉的嫩度和口感等肉品质指标[19]。《中国食物成分2004》[20]参考标准显示羊肉的平均含水量为75.23%(中国食物成分,2004),这与本研究结果一致。本研究中藏绵羊不同部位肌肉含水量均在75%左右,与常明华[21]报道的青海省贵南县白藏绵羊水分含量(75.35%)相当。羊肉中含有丰富的蛋白质,其含量一般为15%～20%。蛋白质含量的高低是衡量肉品质的重要指标,羊肉的蛋白质含量越高,其营养价值也会越高[22]。本研究发现藏绵羊不同部位肌肉蛋白含量均在20%左右,说明藏绵羊肉的营养价值较高,可作为重要的食物蛋白质来源。李述刚[23]对南疆不同品种绵羊的前腿、背最长肌、后腿和尾脂的蛋白含量进行测定发现,同一品种不同部位蛋白含量亦存在较大差异,其中差异最大的是尾脂(蛋白含量只有3.07%),其他部位蛋白含量依次为背最长肌>前腿>后腿。本研究发现藏绵羊小腿肌的蛋白含量最高,其次是背最长肌(P>0.05);腰大肌的蛋白含量极显著低于小腿肌(P<0.01),此研究结果与郭元等[24]对小尾寒羊腿部、前腿、后腿臂三头肌中基因的相对表达量设为1。相同小写字母表示差异不显著(P>0.05),不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

及脊背等不同部位羊肉理化特性比较结果相一致。肌内脂肪 (IMF) 含量是影响畜禽肉质的重要因素之一,与肉的风味、多汁性、嫩度等肉质性状相关[25-26]。肌内脂肪含量越高,导致单位肌肉面积上肌纤维数量减少,使得咀嚼时肉的韧性降低,从而提高肌肉的嫩度和口感[27]。肌内脂肪是由肌内脂肪组织和肌纤维中的脂肪组成,而肌纤维中的脂肪则是由肌浆中的三酰基甘油液滴、膜脂(主要是磷脂)和胆固醇等组成[28]。不同的肌肉解剖部位,肌纤维中三酰基甘油含量的差异很大。乔永[29]在对绵羊羔羊和成年羊的研究中发现,肌内脂肪有较明显的解剖部位差异。本研究发现,背最长肌肌内脂肪含量高于其他部位(P<0.05),与腰大肌肌内脂肪含量差异不显著(P>0.05),而小腿肌肌内脂肪含量最低(1.15%),表明背最长肌相比于其他部位口感和嫩度更好。苗彦芳[30]在对内蒙古白绒山羊背最长肌、股二头肌、股四头肌等11个部位肌肉肉品质的研究中发现,背最长肌沉积脂肪的能力最强。Caneque等[31]对不同胴体质量的Manchego羔羊研究发现,背最长肌和股四头肌相比肌内脂肪含量更高。以上研究均与本研究结果类似。综合来看,小腿肌更符合人们对羊肉高蛋白、低脂肪的要求,而背最长肌在感官体验上优于其他部位肌肉。

骨骼肌是动物肉类产品中最重要的组成部分,肌纤维作为骨骼肌的基本组成单位对动物的产肉力和肉品质有直接影响[32]。肌纤维直径、密度、横截面积是反映肌纤维特性的3个重要指标。研究表明,肌纤维的形成及增殖主要发生于胚胎期,出生后肌纤维数量通常不变,而是以肥大的方式进一步发育,从而导致肌纤维的直径和横截面积增大,同时肌纤维的密度变小[33]。研究表明,肌纤维横截面积和直径增大会降低肌肉的嫩度和系水力[34];相反,肌纤维直径越小,其密度越大,肌内脂肪含量越高,肉的嫩度也就越好,肉品质优良[35]。Fahey等[36]研究发现,肌肉嫩度与肌纤维直径呈负相关,与肌纤维密度呈正相关,而肌纤维横截面积与肉的嫩度呈负相关。本研究发现,藏绵羊不同部位肌肉组织的肌纤维横截面积大小为冈上肌>股四头肌>臂三头肌>小腿肌>胸斜方肌>腰大肌>背最长肌,其中背最长肌的肌纤维横截面积最小,且显著低于其他各部位(P< 0.05);肌纤维直径大小是股四头肌>冈上肌>小腿肌>臂三头肌>腰大肌>胸斜方肌>背最长肌;藏绵羊背最长肌的肌纤维密度最大,且高于冈上肌(P<0.05)。说明背最长肌的嫩度优于其他部位肌肉。此外,肌纤维面积、直径与肌内脂肪含量均呈负相关,而肌纤维密度与肌内脂肪含量呈正相关;肌纤维面积与肌纤维直径呈极显著正相关(r=0.842,P<0.01),而肌纤维面积和肌纤维直径与肌纤维密度均呈极显著负相关(相关系数分别为-0.906、-0.831,P<0.01)。此研究结果与Bunger 等[37]在不同品种绵羊的研究结果相一致。

已有研究证实AKT1、mTOR参与肌肉蛋白合成过程,进而正向调控骨骼肌肥大。而FABPs基因编码脂肪酸结合蛋白,脂肪酸结合蛋白是影响脂肪沉积的重要基因,对机体脂肪代谢具有重要调控作用[38]。有研究表明,AKT1对肌肉中蛋白质合成有正调控作用,mTOR是AKT下游因子,当AKT被激活,引起mTOR的激活进而经由两条主要的传导通路磷酸化下游的效应蛋白p70S6k和4E-BP1(两者均是蛋白翻译的关键调控因子),从而促进肌肉的肥大性生长[39]。栗敏杰等[40]研究表明,AKT1的相对表达量与不同部位肌肉中蛋白质的含量呈中等或强正相关(相关系数0.21～0.65),对肌肉中蛋白质合成有正调控作用,而mTOR作为AKT1的下游因子在肌肉中的相对表达量趋势与AKT1相一致。本研究发现蛋白含量最高的小腿肌中AKT1的相对表达量也显著高于其他部位(P<0.05),且AKT1基因的表达量与蛋白含量呈强正相关(相关系数r=0.601,P<0.01)。mTOR在股四头肌中的相对表达量与小腿肌、背最长肌差异不显著(P>0.05),显著高于臂三头肌、冈上肌及腰大肌(P<0.05),而与胸斜方肌差异极显著(P<0.01),该基因的相对表达量与蛋白含量亦呈正相关(相关系数r=0.291),与栗敏杰等[40]研究结果相一致。综合分析发现,肌肉蛋白质受AKT1和mTOR基因的调控。本研究中mTOR在股四头肌中的相对表达量较高,可能由于藏绵羊机体内AKT-mTOR通路的作用机制与其他品种不同。此外,有研究表明心脏型脂肪酸结合蛋白(FABP3)的表达水平与肌内脂肪密切相关,是影响畜禽肌内脂肪含量的候选主效基因[17]。不同部位肌肉组织中FABP3的相对表达量各有差异。艾锦新等[41]对FABP3基因在黔北麻羊各组织的表达分析,发现FABP3基因在心脏的表达量最高,其次是背最长肌,这与胡江等[17]研究FABP3基因在甘南牦牛各组织的相对表达量结果相一致。本研究中,背最长肌肌内脂肪含量最高,小腿肌中肌内脂肪含量最低,且FABP3在小腿肌中的相对表达量低于除冈上肌外的其他部位(P<0.05)。另外,不同部位肌肉组织中FABP3的相对表达量与肌内脂肪含量呈不同程度的正相关。Huang等[42]对30～90日龄的公哈萨克绵羊肌肉组织进行研究,发现FABP3基因的mRNA表达水平与肌内脂肪含量呈极显著的强正相关。岳彩娟等[43]研究发现,FABP3基因的表达量与滩羊背最长肌、股二头肌及腰大肌肌内脂肪含量均呈正相关。在本研究中,FABP3基因与肌内脂肪含量呈极显著正相关(相关系数r=0.728,P<0.01),与岳彩娟等[43]研究结果相一致,进一步说明FABP3参与调节脂肪代谢。这些研究结果表明,FABP3基因可能是影响动物生长发育的重要基因。

4 结 论

藏绵羊小腿肌中蛋白和肌内脂肪含量更符合人们对羊肉高蛋白、低脂肪的要求,背最长肌的肌内脂肪含量高于其他部位,口感更好。肌纤维特性与肌肉营养成分之间存在不同程度的相关性,其中肌纤维面积、直径与肌内脂肪含量均呈负相关,而肌纤维密度与肌内脂肪呈正相关。AKT1和mTOR基因表达量与藏绵羊不同部位肌肉蛋白质合成呈正相关,FABP3表达量与藏绵羊不同部位肌肉肌内脂肪沉积呈正相关。