不同种植地天麻6种主要成分的比较研究

杨成翠，唐玉凤，程立君，马克坚，高国希，李春燕，杨顺强*

（1.昭通学院 农学与生命科学学院/云南省天麻与真菌共生生物学重点实验室/云南省天麻绿色种植与加工工程研究中心，云南 昭通 657000；2.云南省中医中药研究院，云南 昆明 650000；3.西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100；4. 云南农业大学 农学与生物技术学院，云南 昆明 650000）

天麻是我国传统贵重药材，一般认为天麻素是天麻重要的活性成分，2010 版《中国药典》中天麻质量标准也是以天麻素作为重要的参考指标［1］。随着研究的深入，学者们普遍认为天麻药效作用的发挥主要是其多个成分协同作用的结果，其中天麻素、对羟基苯甲醇（天麻苷元）、对羟基苯甲醛等酚类化合物被认为是天麻的主要活性成分。2020年版《中国药典》中要求天麻供试品色谱中应呈现6个特征峰，样品中天麻素和对羟基苯甲醇的总含量不低于0.25%，另外4个特征峰为巴利森苷类物质的特征峰［2］。随着研究的深入，巴利森苷类物质逐渐被认为是天麻的重要有效成分。刘智慧等［3］研究表明，巴利森苷A和巴利森苷C可显著改善东莨菪碱损伤的空间学习记忆能力，且改善效果优于天麻素；Wang等［4］研究认为，巴利森苷J和巴利森苷B对心肌细胞有显著的保护作用；Wang等［5］研究认为，巴利森苷及其衍生物对6-羟基多巴胺诱导的细胞死亡具有一定的保护作用［5］；康传志等［6］研究表明，天麻素类与巴利森苷类物质在生物合成和积累上存在必然的联系，各成分间在植物机体内必然存在相互转化。天麻生长发育和主要成分的积累受产地条件［7-8］、栽培模式［9-10］、种苗等级［10-11］、天麻种质［5,12-13］等因素的综合影响。但是相同来源的天麻种苗，采用相同的栽培模式在不同环境条件下栽培，其药用活性成分也可能会存在个体和产地间的差异，为此，本研究对不同种植地天麻个体中天麻素、天麻苷元和巴利森苷A、B、C、E 含量进行了比较研究，以期为天麻资源开发利用、品种选育和科学栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2018年1月，将来源于昭通市小草坝镇小草坝村同一种植户，单个重20~30 g的天麻种（乌天麻）分别栽种于云南省昭通市彝良县小草坝镇小草坝村(以下简称小草坝镇，编号XCB)、云南省昭通市镇雄县碗厂镇白岩坝村(以下简称碗厂镇，编号WC)、云南省昭通市永善县水竹乡水竹村(以下简称水竹乡，编号SZ)及贵州省毕节市国家森林公园拱拢坪雷音谷景区(以下简称拱拢坪雷音谷景区，编号GLP)4个不同的种植地。2019年1月20日，分别从上述栽培点采样，采集3个生长健壮，无病虫害，单个重100 g左右的天麻作为样品，用清水洗净，100 ℃蒸制透心，冷却，65 ℃烘干，粉碎过3号筛，备用。3个天麻的混合样为1次重复，重复3次。

1.2 仪器与试剂

LC-30AD高效液相色谱系统包括高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、UV-VIS检测器和色谱工作站（日本岛津公司）。

标准品天麻素（批号110807-201809）和对羟基苯甲醇（批号111970-201702）均购于中国食品药品检定研究院；标准品巴利森苷A（批号PS011129）、巴利森苷B（批号PS011138）、巴利森苷C（批号PS011140）、巴利森苷E（批号PS012053）均购于成都普思生物科技有限公司，纯度均≥98%；乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水。

1.3 试验方法

1.3.1 标准品溶液制备 精密称取适量天麻素、对羟基苯甲醇和巴利森苷A、B、C、E对照品，加75%乙醇溶解，分别制成单个对照品储备液，再分别精密量取各对照品储备液适量，制成混合对照品溶液，置于4 ℃备用。

1.3.2 样品液制备 称取1.0 g左右天麻样品，置于锥形瓶中，加入75%乙醇25 mL，超声提取30min，用微孔滤膜（0.45 μm）过滤，滤液用于天麻素、对羟基苯甲醇及巴利森苷类物质的测定，每个天麻3次重复。

1.3.3 测定方法 采用高效液相色谱法对天麻素、对羟基苯甲醇和巴利森苷含量进行测定。色谱条件：色谱柱为Phernomex Gemini 5 μ C18 110A（4.6 mm×250.0 mm，5μm）；流动相为乙腈(A)、0.1%磷酸水(B)。0~10 min，A∶B=2∶98；10~20 min，A∶B=8∶92；20~30 min，A∶B=12∶88；30~47 min，A∶B=25∶75；47~53 min，A∶B=90∶10；53~60 min，A∶B=2∶98。流速：1.0 mL/min；柱温：40 ℃；检测波长：270 nm；进样量：5 μL。

1.4 数据处理

试验数据采用 Microsoft Excel 2016 软件进行处理，采用SPSS 21.0统计软件对数据进行方差分析和多重比较（新复极差法）。

2 结果与分析

2.1 标准品和样品成分分离测定

将混合标准液和天麻样品提取液上机检测，在50 min内，标准液检测出了天麻素(GA)、对羟基苯甲醇(HA)和巴利森苷A(PA)、巴利森苷B(PB)、巴利森苷C(PC)、巴利森苷E(PE)6种天麻的主要成分，获得了基线稳定、无拖尾、灵敏度高的理想图谱。天麻样品液也检测出了多种天麻的主要成分（图1）。根据混合标准溶液的图谱，以质量浓度对峰面积制作标准曲线，得出各成分浓度与峰面积的线性回归方程，线性关系良好（表1），可作为样品中各成分含量计算使用。

表1 天麻6种主要成分的回归方程及相关系数

图1 混合对照品溶液和天麻样品的HPLC色谱图

2.2 天麻样品重量及含水量

由表2可以看出，不同种植地天麻样品平均鲜重差异不显著，其中SZ种植地天麻样品的平均鲜重最重，为104.737 g/个；XCB、SZ和WC这3个种植地天麻样品的平均干重差异不显著，WC种植地天麻样品的平均干重最重，为26.818 g/个，显著高于GLP种植地的；GLP种植地天麻样品的平均含水量最高，为80.18%，显著高于SZ和WC这2个种植地的，WC种植地天麻样品的含水量最低，为74.10%，上述分析表明种植地不同影响了天麻的含水量。

表2 不同种植地天麻样品含水量和重量

2.3 同一种植地天麻样本间主要成分的含量

同一种植地天麻样本间GA、HA、PA、PB、PC、PE含量及巴利森苷总量差异明显（表3）。XCB种植地天麻样本间的GA含量差异极显著，其中XCB-1样本中的GA含量最高，为2.186 mg/g；XCB-2样本中的HA、PA、PB和PC含量均最高，分别为0.750、6.596、2.895和1.358 mg/g，均极显著高于XCB-1和XCB-3的；XCB-3样本中的PE含量极显著高于XCB-1和XCB-2的，为9.693 mg/g。SZ种植地的天麻样本间，SZ-2中的GA、HA、PA、PB和PC含量均极显著高于SZ-1和SZ-3的，分别为：2.313、1.167、14.377、4.665和2.586 mg/g；SZ-3中的PE含量极显著高于SZ-1和SZ-2的，为8.999 mg/g。WC种植地的天麻样本间，WC-1和WC-2中的PC含量分别为1.695、1.684 mg/g，极显著高于WC-3的，而在WC-1和 WC-2间差异不显著；WC-1中的PE含量为13.074 mg/g，极显著高于WC-2和 WC-3的；WC-2中的GA、HA、PA和PB含量均最高，分别为0.207、3.534、12.953和3.964 mg/g。GLP种植地的天麻样本间，GLP-1样本中的GA、PC和PE含量均极显著高于GLP-2和GLP-3的，分别为3.849、2.310和4.260 mg/g；GLP-2中的PA含量最高，为6.753 mg/g，极显著高于GLP-1和GLP-3的；GLP-3中的HA和PB含量均极显著高于GLP-1和GLP-2的，分别为1.047和3.946 mg/g。各种植地天麻样本间巴利森苷总量差异均达极显著水平，其中SZ-2样本的高达27.847 mg/g，GLP-2的仅为11.540 mg/g。

表3 不同产地天麻中主要成分含量 mg/g

2.4 不同种植地天麻主要有效成分的含量

由表3可知，不同种植地天麻样本间GA的平均含量差异明显，其中GLP种植地的平均含量最高，WC种植地的平均含量最低，分别为3.378和0.198 mg/g；WC种植地的HA平均含量为2.340 mg/g，显著高于其他3个种植地的，XCB、SZ和GLP这3个种植地样本间的HA平均含量差异不显著。各种植地间PA、PB、PC和PE的平均含量差异均不显著，其中，SZ种植地的PA、PC平均含量均最高，分别为10.179和1.904 mg/g，XCB种植地的均最低，分别为4.623、0.968 mg/g。WC种植地的PE平均含量最高，为7.952 mg/g，GLP种植地的最低，仅为3.411 mg/g。巴利森苷总量平均值从高到低依次为SZ（22.371 mg/g）＞WC（19.869 mg/g）＞XCB（15.388 mg/g）＞GLP（13.011 mg/g）。不同种植地天麻中GA、HA、PA、PB、PC、PE的平均含量及巴利森苷总量的平均值差异较大，但大多差异不显著。

3 讨论与结论

康传志等［14-17］研究表明，巴利森苷是天麻素和柠檬酸缩合而成的酯类物质，天麻素和巴利森苷等主要成分在天麻体内存在相互转化。本试验中，不同种植地间GA和HA含量差异明显；PA、PB、PC、PE含量和巴利森苷总量差异较大，但均未达显著水平，表明天麻中主要有效成分含量因种植地环境不同而存在差异。这可能是因为不同种植地生态环境条件的不同而影响了天麻主要成分的转化和积累，可为天麻高品质定向科学栽培提供依据。

郑治洪等［18-21］对不同规格等级的天麻主要成分做了大量研究，发现天麻主要成分含量因天麻规格等级不同而存在差异。本试验中，同一种植地相似规格的各天麻样本间GA、HA、PA、PB、PC、PE含量和巴利森苷总量差异明显。表明同一栽培环境下，同一规格等级的天麻样本间各成分含量差异较大，天麻个体生长发育、主要成分转化和积累等因天麻个体不同而存在差异，导致天麻主要成分含量个体差异较大。这为天麻品种选育和科学栽培提供了启示。