基于IGF-1R/PI3K/AKT的益气固表丸对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠的影响及作用机制研究

徐丹　荆晶　李争　王晶　姜敏　王益德　张艳丽

摘要 目的：益氣固表丸对慢性阻塞性肺疾病（COPD）有明显的治疗作用，但具体作用机制尚不清楚。本研究旨在探讨益气固表丸对脂多糖（LPS）联合烟雾暴露构建慢性阻塞性肺病模型大鼠的治疗作用机制。方法：通过大鼠气管内灌注LPS和吸入香烟烟雾构建慢性阻塞性肺病模型，同时给予模型大鼠低、中、高剂量益气固表丸治疗14 d。观察呼吸参数及肺组织病理变化。采用酶联免疫吸附试验测定支气管肺泡灌洗液（BALF）及血清胰岛素样生长因子1型受体（IGF-1R）、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-10水平。采用蛋白质印迹法检测大鼠肺组织样品中胰岛素样生长因子1受体（IGF-1R）/PI3K/AKT信号通路组分的磷酸化状态。结果：与对照组和低剂量益气组比较，大剂量益气固表丸治疗可显著改善COPD大鼠呼吸参数，减轻肺损伤和炎症，降低BALF和血清炎症介质水平。此外，高剂量益气固表丸干预的COPD大鼠肺组织标本中磷酸化IGF-1R、p-PI3K、p-AKT、p-GSK3、p-mTOR蛋白水平显著降低。结论：益气固表丸对COPD有明显的治疗作用，可能与靶向IGF-1R/PI3K/AKT信号通路有关。

关键词 益气固表丸；脂多糖；慢性阻塞性肺疾病；IGF-1R/PI3K/AKT信号通路；作用机制；胰岛素样生长因子1受体；白细胞介素-1β；白细胞介素-10

Effects and Mechanism of Yiqi Gubiao Pills on Chronic Obstructive Pulmonary Disease in Model Rats Based on IGF-1R/PI3K/AKT Signaling Pathway

XU Dan1，2，3，JING Jing1，2，3，LI Zheng1，2，3，WANG Jing1，2，JIANG Min1，2，WANG Yide1，2，3，ZHANG Yanli3

（1 National Clinical Research Base of Traditional Chinese Medicine，Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830090，China; 2 Xinjiang Key Laboratory Respiratory Disease Research，Urumqi 830090，China; 3 Respiratory Department，Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Xinjiang Medical University，Urumqi 830090，China）

Abstract Objective：Yiqi Gubiao Pills have a definite therapeutic effect on chronic obstructive pulmonary disease（COPD），but the specific mechanism of action remains unclear.This study aimed to explore the therapeutic mechanism of Yiqi Gubiao Pills in the treatment of COPD in rats induced by lipopolysaccharide（LPS） combined with cigarette smoke exposure.Methods：The COPD model was induced in rats by intratracheal instillation of LPS and cigarette smoke inhalation.Meanwhile，the model rats were treated with low-，medium-，or high-dose Yiqi Gubiao Pills for 14 days.The respiratory parameters and pulmonary histopathological changes were examined.The enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was conducted to measure the levels of insulin-like growth factor 1 receptor（IGF-1R），interleukin（IL）-1β，and IL-10 in bronchoalveolar lavage fluid（BALF） and serum.Western blot was used to determine the phosphorylation of the components in the IGF-1R/PI3K/AKT signaling pathway in the lung tissues of rats.Results：Compared with the control group and the low-dose Yiqi Gubiao Pills group，the high-dose Yiqi Gubiao Pills group showed significantly improved respiratory parameters，alleviated lung injury and inflammation，and reduced proinflammatory cytokine levels in BALF and serum of COPD rats.Furthermore，high-dose Yiqi Gubiao Pills could significantly reduce the protein levels of phosphorylated（p）-IGF-1R，p-PI3K，p-AKT，p-GSK3，and p-mTOR in the lung tissues of COPD rats.Conclusion：Yiqi Gubiao Pills have a definite therapeutic effect on COPD，and the mechanism may be related to targeting the IGF-1R/PI3K/AKT signaling pathway.

Keywords Yiqi Gubiao Pills; Lipopolysaccharide; Chronic obstructive pulmonary disease; IGF-1R/PI3K/AKT signaling pathway；Mechanism of action；Insulin-like growth factor 1 receptor；Interleukin-1β；Interleukin-10

中图分类号：R256.14文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2023.01.014

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种进行性和部分可逆的慢性肺部疾病，其特征是有毒颗粒或气体对气道和肺诱导的慢性炎症反应导致气流阻塞［1］，吸烟是COPD的主要危险因素［2］，患病率为8.80%～14.53%［3］，全球每年有200多万人死于COPD［4］。据预测到2030年COPD将上升到全球第3大死亡原因［5］。因此，制定有效的方法来预防COPD的发展是非常重要的。

近年来研究人员发现，中医实践中常用的益气固表丸可以改善COPD大鼠肺功能，缓解肺部炎症［6］。临床随机、双盲实验研究表明益气固表丸可改善稳定期COPD患者的喘息、咳嗽、咳痰等症状［7-8］。益气固表丸的主要中药党参、白术、黄芩等已被证明具有体内外免疫调节和抗炎作用［9-11］；黄芩治疗COPD大鼠可减轻气道重塑［11］。然而，益气固表丸治疗COPD疗效的确切机制尚不清楚。

胰岛素样生长因子1受体（Insulin-like Growth Factor Type1 Receptor，IGF-1R）是一种通过IGF1和IGF2结合激活的跨膜酪氨酸激酶，在肺癌、炎症、纤维化等肺部发育和疾病中发挥重要作用［12］。IGF1结合IGF-1R激活参与COPD发病机制的磷脂酰肌醇3激酶（Phosphoinositide 3-Kinase，PI3K）/蛋白激酶B（Protein Kinase B，AKT）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）信号通路［13］。COPD中存在IGF1/IGF-1R信号通路表达异常［12］。研究表明，PI3K信號通路在COPD中被激活导致包括AKT、糖原合成酶激酶3（Glycogen Synthase Kinase-3，GSK3）和mTOR等下游介质磷酸化水平升高［14-15］，PI3K亚型因此成为COPD潜在治疗靶点［16］。PI3Kδ抑制剂GSK2269557的临床试验在COPD患者中取得了良好的治疗效益和安全性［17-18］。因此，我们推测益气固表丸可能通过靶向IGF-1R/PI3K/AKT信号通路来改善COPD症状。

为了验证这一假设，我们前期已经采用网络药理学方法确定益气固表丸治疗COPD潜在治疗靶点和机制［19-21］，本研究进一步评估益气固表丸对脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）联合吸烟诱导的COPD模型大鼠经肺损伤和炎症的治疗作用，结果提示益气固表丸可通过阻断IGF-1R/PI3K/AKT信号通路减轻COPD肺损伤和炎症反应，为益气固表丸治疗COPD的作用机制研究提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 雄性Wistar大鼠75只，8周龄，体质量（200±50）g。购自新疆医科大学动物中心，生产许可证号：SYCK（新）2018-0002，使用许可证号：SYSK（新）2018-0003。所有动物护理和实验程序均由新疆医科大学伦理委员会批准（伦理审批号：IACUC-201905301-37）。所有动物实验均按照《新疆医科大学动物实验正确实施指南》进行。

1.1.2 药物 益气固表丸购自新疆医科大学附属中医院中心药房。

1.1.3 试剂与仪器 ELISA试剂盒（联科生物，批号：70-EK301B/3-96，70-EK310/2-96），RIPA（放射免疫沉淀法）缓冲液（Boster生物技术，批号：AR0105）；IGF抗体（Abcam，英国，批号：ab182408），IGF-1R（武汉华美，批号：CSB-E13873r）PI3抗体（Abcam，英国，批号：ab191606），AKT 1/2/3抗体（Abcam，英国，批号：ab179463），Anti-GSK3 Beta+GSK3 Alpha抗体（Abcam，英国，批号：ab185141），mTOR抗体（Abcam，英国，批号：ab32028）；倒置显微镜（尼康，日本，型号：E200），小动物肺功能全身容积描记仪（Buxco，英国，型号：WBP），酶标仪（Bio-Rad，美国，型号：xMarkTM），化学发光成像仪系统（上海勤翔科学仪器有限公司，型号：Chemiscope 3000），蛋白转膜（Bio-Rad，英国，型号：Mini-PROTEAN Tetra system）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将大鼠随机分为对照组、慢阻肺组、慢阻肺+益气固表低剂量组、慢阻肺+益气固表中剂量组、慢阻肺+益气固表高剂量组，每组15只。采用吸入烟雾、气管内灌注LPS的方法建立大鼠COPD模型［22-23］。大鼠在烟草烟雾室中暴露于香烟烟雾（12 mg焦油，1.1 mg尼古丁和14 mg一氧化碳）1 h，2次/d，4 h无烟间隔/次，持续90 d。对照组大鼠暴露于室内空气中，在第30天进行气管内灌注LPS。大鼠经腹腔注射0.4%戊巴比妥钠溶液（50 mg/kg）麻醉，气管内灌注LPS 100 μL（2 mg/mL）。对照组大鼠给予等量0.9%生理盐水。

1.2.2 给药方法 从第1天开始，用含0.66 g/kg（低剂量）、1.31 g/kg（中剂量）、2.62 g/kg（高剂量）益气固表丸的水溶液10 mL/kg灌胃给大鼠，1次/d，连续14 d。根据美国食品药品监督管理局建议的公式：人当量剂量=大鼠剂量×0.16，中剂量可与临床应用的人相当；对照组和COPD组大鼠给予等量蒸馏水。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 呼吸参数测量 益气固表丸治疗14 d后，采用全身容积描记仪测定呼吸频率（Respiratory Frequency，f）、潮气量（Tidal Volume，TVb）、每分钟通气量（Minute Ventilation Volume，MVb）、吸气峰流量（Peak Inspiratory Flow，PIFb）、呼气流量峰值（Peak Expiratory Flow，PEFb）、吸气时间（Inspiratory Time，Ti）、呼气时间（Expiratory Time，Te）和50%潮气量呼气流量（Tidal Expiratory Flow at 50% of Tidal Volume，TEF50）等呼吸参数。

1.3.2 苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin，HE）染色法觀察病理学改变 所有大鼠于第90天处死。采集肺组织样本，用4%多聚甲醛固定，制备4 μm厚的组织切片，并进行HE染色。采用倒置显微镜观察肺泡壁增厚、中性粒细胞浸润等组织病理学改变。

1.3.3 酶联免疫吸附试验 经37 ℃，2次灌注生理盐水30 mL，于4 ℃，3 000×g离心15 min，第90天收集支气管肺泡灌洗液。收集上清，-80 ℃保存。根据生产商的说明书，使用ELISA试剂盒测定支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF）中IGF-1R、白细胞介素（Interleukin，IL）-1β和IL-10浓度。

1.3.4 蛋白质印迹法（Westen Blooting）分析 大鼠肺组织标本于第90天采集，用RIPA缓冲液在冰上均质，然后离心半径15 cm，12 000 r/min离心15 min。使用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，转移到聚偏氟乙烯膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭1 h。然后用抗IGF-1R的一抗（1∶500；ab182408），p-IGF-1R（1∶500；ab39398），PI3K（1∶1 000；ab191606），p-PI3K（1∶2 000；ab182651），一种蛋白激酶（1∶800；ab179463），p-AKT（1∶800；ab192623），人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（Phosphatase and Tensin Homologue Deleted on Chromosome Ten，PTEN）；（1∶2 000；GSK3 ab32199），（1∶1 000；ab185141），p-GSK3（1∶800；ab68476），mTOR（1∶800；ab32028），p-mTOR（1∶800；ab137133），或β肌动蛋白（1∶800）在4 ℃过夜，然后用含0.1% Tween 20（TBST）的tris缓冲盐水洗3次。然后用辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶500；ab205718；Abcam）在室温下保存1 h。再用洗涤缓冲液（Tris Buffered Saline Tween，TBST）洗3次后，使用Chemiscope 3000对蛋白条带进行可视化和分析。

1.4 统计学方法 采用Prism 6.0统计软件（Graphpad，San Diego，CA，USA）进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示。组间比较采用t检验或方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 益气固表丸对COPD大鼠呼吸参数的影响 与对照组比较，LPS+香烟烟雾暴露导致大鼠呼吸频率显著增加，TVb、MVb、PIFb、PEFb、Ti、Te、EF50显著降低，说明COPD大鼠模型建立成功。益气固表丸治疗COPD组大鼠呼吸频率降低，其他参数升高，且呈剂量依赖性，提示益气固表方可改善COPD大鼠呼吸功能。见表1。

2.2 大剂量益气固表丸对COPD大鼠肺组织病理学的影响 观察益气固表丸对COPD肺损伤的作用。肺组织标本HE检查显示，与对照组比较，COPD大鼠表现出明显的结构改变和炎症反应，包括肺泡损伤、支气管上皮损伤、炎症细胞浸润。与对照组、低、中剂量益气固表丸治疗比较，高剂量益气固表丸治疗可预防COPD大鼠肺组织肺泡、支气管上皮破裂及淋巴细胞和炎症细胞浸润。见图1。

2.3 大剂量益气固表丸可调节COPD大鼠BALF及血清细胞因子水平 高剂量益气固表丸显著降低COPD大鼠BALF和血清中IL-1β水平，升高IL-10水平。BALF和血清IGF-1R水平无明显变化。见表2～3。

2.4 大剂量益气固表丸抑制COPD大鼠IGF-1R/PI3K/AKT信号通路 与对照组比较，COPD大鼠肺组织标本中p-IGF-1R、p-PI3K、p-AKT、p-GSK3蛋白水平显著升高，PTEN、p-mTOR蛋白水平显著降低。与对照治疗比较，益气固表丸高剂量治疗可有效阻断COPD大鼠IGF-1R/PI3K/AKT信号通路的激活。见图2A～G。

3 讨论

前期研究通过整合中医研究中广泛使用的网络药理学数据库和工具［24］，我们发现益气固表丸在COPD治疗中可能与调控PI3K/AKT信号通路有关。本研究结果显示，与对照组、益气固表丸低、中剂量组比较，高剂量益气固表丸治疗可有效预防LPS联合烟雾暴露诱导的COPD大鼠的疾病进展，

改善呼吸參数，减轻肺组织病理异常，抑制COPD大鼠BALF和血清细胞因子水平。此外，高剂量益气固表丸治疗COPD大鼠可阻断IGF-1R/PI3K/AKT信号通路的激活进而抑制COPD的疾病发展。

COPD小鼠模型常采用吸入香烟烟雾加气管内注射LPS进行诱导［23］。本研究结果表明，与对照组比较，COPD大鼠出现了明显的呼吸功能受损，COPD组出现了典型的肺组织病理学改变，细胞因子分泌失调，说明COPD大鼠模型建立成功。我们进一步发现，以2.62 g/kg益气固表丸汤治疗14 d，可有效防止大鼠COPD疾病进展。与JIANG等［6］研究一致，2.36 g/kg益气固表丸可改善慢性阻塞性肺疾病大鼠的咳嗽潜伏期和频率、呼吸阻力以及气管黏膜和肺的组织病理学改变。提示益气固表丸是一种有前景的治疗COPD药物。

COPD与肺和全身炎症反应密切相关，以血液炎症介质水平升高为特征，在晚期中更为明显［25］。IL-1β是一种典型的炎症介质，在COPD中启动和维持气道炎症起关键作用［26］。COPD急性加重患者中血清IL-1β水平明显高于稳定期患者或健康对照组，且与血清C反应蛋白和IL-17水平正相关，可作为持续气道炎症和COPD持续加重的指标［27］。另一方面，IL-10被认为是COPD中的一种抗炎细胞因子。ZHANG等［28］研究证明，与健康的非吸烟对照组比较，健康吸烟者和COPD患者血清和痰中IL-10水平均显著降低。最近的一项研究报道，血清IL-10水平低与COPD患者呼吸参数恶化相关［29］。SILVA等［30］发现COPD患者的病情严重程度与血清IL-10水平负相关。在COPD中，BALF和血清细胞因子水平的变化反映肺部和全身炎症水平［31］。因此，我们试图确定益气固表丸是否能影响COPD患者BALF及血清细胞因子水平。与上述结果一致，本研究数据显示，与对照组比较COPD大鼠BALF和血清中IL-1β水平显著升高，IL-10水平降低，高剂量益气固表丸治疗可有效逆转这一现象。结合HE染色结果，提示大剂量益气固表丸可缓解COPD患者的肺部和全身炎症反应。

前期生物信息学分析结果提示益气固表丸在COPD治疗中可能靶向PI3K/AKT信号通路。考虑到IGF-1R信号主要激活PI3K/AKT下游信号通路，我们假设益气固表丸方可能在COPD治疗中调节IGF-1R/PI3K/AKT信号通路。有报道称IGF-1R/AKT/mTOR信号通路的激活通过抑制受损细胞成分的自噬消除而参与COPD的发病［32］。消耗IGF-1R可保护小鼠免受氧诱导的肺损伤［33］。消蚀IGF1-IGF1R轴可抑制巨噬细胞中核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（Nucleotide-binding Oligomerization domain-like Receptor Protein 3，NLRP3）炎症小体，提示IGF-1R对肺炎症的启动至关重要［34］。为了研究IGF-1R/PI3K/AKT信号通路在益气固表丸治疗COPD中的作用，我们检测了大鼠肺组织样本中该通路成分的磷酸化状态。在本研究中，益气固表丸治疗COPD大鼠并未影响BALF和血清IGF-1R水平，可能是因为IGF-1R不是分泌蛋白，而大剂量益气固表丸治疗后COPD大鼠肺组织标本中IGF-1R及下游效应因子磷酸化水平显著升高。相反，PI3K的负调控因子PTEN的蛋白表达在高剂量益气固表丸治疗后显著上调［35］。以上数据提示，大剂量益气固表丸可通过抑制IGF1R/PI3K/AKT信号通路抑制COPD的发展。

综上所述，在本研究中提示PI3K/AKT通路是益气固表丸治疗COPD的潜在治疗靶点。高剂量益气固表丸（2.62 g/kg）通过抑制IGF1R/PI3K/AKT信号通路可减轻COPD大鼠肺损伤和炎症，本研究为益气固表丸治疗COPD的作用机制研究提供了新思路。

利益冲突声明：无。

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（2021-08-26收稿 本文編辑：吴珊）

基金项目：新疆维吾尔自治区自然科学基金项目（2018D01C282）作者简介：徐丹（1983.01—），女，硕士，副主任医师，研究方向：中西医结合呼吸病学，E-mail：66601443@qq.com通信作者：张艳丽（1985.04—），女，博士，副主任医师，研究方向：中西医结合呼吸病学，E-mail：171179265@qq.com