肝癌组织角蛋白23表达与患者临床病理特征及预后关系研究

董 勇,程 序,梁 晗,华 静,谭莉霞,王航宇,闫春晓,魏书堂

(河南大学第一附属医院消化内科,河南 开封 475100)

原发性肝癌作为恶性肿瘤,其发病率在全世界肿瘤中排第5位[1]。中国是肝癌高发地区,临床发病率有持续上升趋势。目前尽管肝癌的治疗措施已取得显著进步,但患者3年生存期仍未获得显著延长[2]。肝癌的发展是多因素造成的结果。因此,寻找参与肝癌发生、发展的生物分子标志物在临床上有重要意义。角蛋白属于中间丝蛋白家族成员,大量表达于上皮细胞,且与细胞分化密切相关[3]。杭群等[4]研究显示,角蛋白23(Keratin 23,KRT23)在胃癌患者癌组织中高表达,其表达水平与淋巴结转移、TNM分期紧密相关。KRT23是一种应激诱导蛋白,其表达水平与肝病的严重程度相关[5]。但目前KRT23在肝癌中的作用研究尚不清楚。因此,本研究探讨肝癌患者癌组织中KRT23表达变化,并分析其与肝癌患者临床病理特征及预后的关系,期望为评估肝癌预后提供有价值的参考依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2018年1月至2019年6月就诊于河南大学第一附属医院并接受手术治疗的肝癌患者86例,其中男性48例,女性38例;年龄38～80岁,平均(60.24±10.84)岁。病例纳入标准:符合《原发性肝癌的临床诊断与分期标准》[6]中的病理诊断标准;术前未进行全身化疗、放疗;签署知情同意书。排除标准:肾功能障碍;合并急慢性炎症疾病、免疫系统疾病;患其他恶性肿瘤、全身感染性疾病。本研究已通过医院伦理委员会审批。

1.2 标本收集 收集所有患者的肝癌组织及癌旁正常组织(距离癌组织5 cm以上),一份迅速置于液氮冷冻后备用,另一份制作成石蜡标本。收集的肝癌组织及癌旁组织均经病理检查证实。

1.3 免疫组织化学法检测KRT23表达水平 将肝癌组织和癌旁正常组织的石蜡标本进行切片(厚度约3 μm)、烘干。将切片进行脱蜡,用枸橼酸钠抗原修复液进行抗原修复。采用3% H2O2阻断浸泡5 min,再冲洗。将KRT23单克隆抗体(货号:ab156569,Abcam公司)滴加于组织上,4 ℃冰箱过夜。应用二抗(货号:ab6721,Abcam公司)室温孵育1 h,PBS液冲洗。DAB显色5 min,苏木素复染2 min,再分化、返蓝、脱水、封片,于显微镜下观察切片。由2名以上高年资病理医师独立读片评定,结果不一致时共同商议。每例标本随机计数5个视野(200倍),计数视野中阳性细胞所占百分比,染色强度标准参照文献[7]。

1.4 蛋白免疫印迹检测KRT23蛋白水平 提取组织中总蛋白,用BCA蛋白定量试剂盒(货号:AWB0104b,长沙艾碧维生物科技有限公司)对总蛋白进行定量分析。取50 μg总蛋白用SDS-PAGE进行电泳以分离蛋白,然后进行湿法转膜至PVDF膜上,在5% BSA中封闭1 h,加入兔抗人KRT23(货号:ab156569,Abcam公司)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(货号:ab181602,Abcam公司,稀释比例1∶1000)4 ℃过夜,再加入二抗(货号:ab6721,Abcam公司,稀释比例1∶500)37 ℃孵育1 h,ECL显色后观察。以GAPDH为内参,计算肝癌组织或癌旁组织中KRT23蛋白相对表达水平。

1.5 术后随访 收集肝癌患者术后随访门诊记录或复查记录,最长随访时间为3年,随访至2022年6月,记录患者生存时间。总生存期为开始治疗至死亡或失访的时间。

2 结 果

2.1 肝癌组织与癌旁正常组织KRT23相对表达水平比较 蛋白免疫印迹结果显示,癌旁正常组织KRT23相对表达水平为1.03±0.13,肝癌组织KRT23相对表达水平为1.36±0.18,后者高于前者(t=13.783,P<0.05)。免疫组织化学检测结果(图1)显示,肝癌组织及癌旁正常组织KRT23阳性表达率分别为80.23%(69/86)和29.07%(25/86),前者高于后者(χ2=45.416,P<0.05)。

图1 肝癌组织KRT23阴性(左)

2.2 KRT23表达水平与患者临床病理特征的关系 见表1。86例患者中,TNM分期(美国肿瘤联合委员会AJCC 2018)Ⅰ-Ⅱ期34例,Ⅲ期52例;甲胎蛋白(AFP)<400 μg/L 54例,≥400 μg/L 32例;乙肝表面抗原(HBsAg)阳性66例,阴性20例;Child-Pugh分级中,A级76例,B级10例。分析结果显示,Ⅲ期肝癌患者肝癌组织KRT23阳性表达水平显著高于Ⅰ-Ⅱ期肝癌患者(P<0.05)。

表1 KRT23表达与肝癌患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.3 影响肝癌患者预后的危险因素分析 见表2。以肝癌患者3年预后为因变量(预后良好=0,预后不良=1),将年龄(<60岁=0,≥60岁=1)、性别(女=0,男=1)、AFP(<400 μg/L=0,≥400 μg/L=1)、TNM分期(Ⅰ-Ⅱ期=0,Ⅲ期=1)、乙肝表面抗原(阴性=0,阳性=1)、Child-Pugh分级(A级=0,B级=1)、KRT23表达水平(阴性=0,阳性=1)作为自变量进行Cox回归分析。单因素Cox回归分析表明,TNM分期、KRT23均是影响肝癌患者预后不良的危险因素(均P<0.05)。多因素Cox回归分析表明,TNM分期Ⅲ期、KRT23阳性是肝癌患者预后不良的独立危险因素(均P<0.05)。

表2 影响肝癌患者预后危险因素Cox回归分析

2.4 肝癌组织中KRT23表达与预后的关系 见图2。KRT23阴性患者3年累积生存率为64.70%,KRT23阳性患者3年累积生存率为29.00%,后者低于前者(Log-Rank χ2=6.899,P=0.009)。

图2 肝癌患者3年随访期间Kaplan-Meier生存曲线

3 讨 论

肝癌是我国常见肿瘤[8]。目前,手术切除是延长肝癌患者生存期的有效办法,但大部分肝癌患者确诊时已处于中晚期,能够手术治疗者不到15%[9]。临床研究[10-11]发现,肝癌患者术后复发率也较高,预后较差。因此,深入探究肝癌的发生、发展机制具有重要的临床意义。

中间丝蛋白家族是细胞骨架的重要组成部分,由中间丝蛋白组成的细胞骨架支撑整个细胞。中间丝蛋白家族有5种主要类型,Ⅰ-Ⅳ型是构成细胞质的蛋白,Ⅴ型是构成细胞核骨架的蛋白[12]。角蛋白是中间丝蛋白家族主要的成员,包含Ⅰ和Ⅱ型[13]。角蛋白是中间链接蛋白与微丝蛋白,均表达于上皮细胞中。在机体细胞发生异常凋亡时,角蛋白表现出高度活性。角蛋白可直接参与细胞有丝分裂、分化及凋亡等过程,可调节细胞形态、运动力、蛋白质合成及膜运输过程[14]。角蛋白侵袭能力强,在癌症的侵袭和转移中具有关键作用。有研究[14-15]证实,肝癌组织中角蛋白19、角蛋白7表达高的患者预后更差,且角蛋白磷酸化后引起结构重塑,可增强肝癌细胞的侵袭能力。肝癌细胞体内存在侵袭和转移[16]。

研究[17]显示,角蛋白在细胞膜屏障功能中起重要作用。据报道,角蛋白的异常表达与癌细胞的侵袭和迁移有关[18]。KRT23是角蛋白基因家族中一个新的Ⅰ型成员。研究[19]证实,KRT23通过TGF-β/Smad信号通路调控上皮间质转化,进而调节卵巢癌细胞迁移,体外实验表明KRT23的敲低抑制了卵巢癌细胞迁移和侵袭。Kim等[20]研究证实,过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARA)是一种配体激活的转录因子和脂质代谢的关键介质,慢性PPARA激活会导致小鼠的肝细胞增殖、肝肿大,并最终导致肝细胞癌,PPARA激活提高了瘤细胞病毒癌基因(MYC)表达,MYC又增强了参与癌细胞增殖的相关基因KRT23的表达。研究[21]报道,在KRT23受到组蛋白脱乙酰化酶抑制剂诱导转录增加的过程中,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p2lWAF1/CIPI起到关键的调节作用,证明KRT23参与细胞分化。研究[22]显示,KRT23过表达上调了结肠癌细胞中端粒酶逆转录酶(hTERT)活性及hTERT启动子驱动的荧光素酶和端粒酶活性的升高,而结肠癌细胞中KRT23的敲低抑制了与细胞周期和DNA修复相关的关键分子的表达,从而阻止了结肠癌细胞的增殖。本研究蛋白免疫印迹检测结果显示,肝癌组织中KRT23相对表达水平明显高于癌旁正常组织,提示KRT23可能影响肝癌的发生。

本研究显示,肝癌组织中KRT23阳性表达率显著高于癌旁正常组织,且Ⅲ期肝癌患者肝癌组织中KRT23表达水平显著高于Ⅰ-Ⅱ期肝癌患者,提示KRT23参与肝癌的发生与发展。角蛋白影响肿瘤的侵袭、转移过程,肿瘤组织中存在角蛋白裂解片段或全长片段,提示癌症患者存在较差预后[18]。本研究预后分析显示,KRT23阴性患者3年累积生存率高于KRT23阳性患者,提示KRT23可能影响肝癌患者预后,表明KRT23阳性可能对肝癌患者预后不良的预测有贡献。本研究还发现,KRT23阳性是肝癌患者预后不良的独立危险因素。

综上所述,肝癌组织KRT23呈高表达,且与肝癌患者预后不良有关,有望成为预测肝癌患者预后不良的生物学指标。