不同加工工艺对大豆多肽形成的影响

杨培周，陆书花，杨雨翰，李丛旭，王泽民

（1. 合肥工业大学食品与生物工程学院，农产品精深加工安徽省重点实验室，安徽合肥 230601；2. 安徽红花食品有限公司，安徽 蚌埠 233799）

0 引言

大豆的主要成分包含约40%蛋白质、20%脂肪、碳水化合物和灰分，是人体蛋白质摄入的重要来源[1]。大豆蛋白作为植物性蛋白质，其氨基酸组成与牛奶蛋白质相近，营养价值与动物蛋白等同，基因结构也最接近人体氨基酸，半胱氨酸和甲硫氨酸等含硫氨基酸是大豆蛋白中的营养限制性氨基酸[2]。大豆胰蛋白酶抑制剂在大豆中的含量较高，不利于人们吸收消化大豆蛋白。为了改变大豆蛋白的功能、营养和感官特性，利用蛋白酶将蛋白质水解为多肽和氨基酸是最常用且绿色的一种方式[3]。酶法改性技术是利用蛋白酶内切作用及外切作用将蛋白分子切割成小分子，使其蛋白功能特性有所改变。酶法改性具有过程温和、无副反应、易于控制等优点[4]。不同酶水解大豆蛋白会得到不同的多肽且具有不同的特性，蛋白酶及条件选择是酶解的关键。王艳[5]通过蛋白酶轻度水解大豆蛋白，破环大豆蛋白的部分致敏表位，使其致敏性降低或消除后深度水解，获得低致敏性肽。有研究发现与木瓜蛋白酶消化的肽相比，碱性蛋白酶制备肽过程中，表现出高α - 葡萄糖苷酶抑制活性。从Kocuria kristinae F7 中分离得到57 kDa 碱性蛋白酶处理大豆蛋白后得到4 个新的亲水肽。柠檬酸作用于蛋白质时，破坏蛋白质次级键，形成分子量较小的蛋白肽[6]。此外，大豆含有丰富的内源蛋白酶，在经过处理后，内源蛋白酶能够催化大豆自身蛋白形成大豆多肽[7-8]。

考查大豆粉碎打浆、柠檬酸处理和蛋白酶处理等工艺对大豆多肽形成的影响，测定大豆多肽质量浓度变化，利用蛋白电泳表征大豆蛋白种类和特征，以期为制备大豆多肽提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂耗材和仪器设备

黄豆，产自北京市密云区；风味蛋白酶，河南万邦化工科技有限公司提供；碱性蛋白酶，河南仰韶生物酶制剂有限公司提供；木瓜蛋白酶，南宁庞博生物工程有限公司提供；低分子量蛋白质Marker（14.4～97.4 kDa）、超低分子量蛋白Marker（3.3～20.1 kDa）、Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒（P1320-25T） 和4×蛋白上样缓冲液（含巯基还原剂），Solarbio 生物科技公司提供；氢氧化钠、柠檬酸、甲醇等为分析纯，国药集团提供。

L18-P132 高速破壁调理机，九阳股份有限公司产品；凝胶成像仪，美国Bio-Rad 公司产品；UV-1201 型紫外分光光度计，北京瑞利公司产品；EPS-300 DNA 型电泳设备，上海天能科技产品；pHS-25型pH 计，大普仪器有限公司产品；HH-4 型水浴锅，国华电器公司产品；5430R 型低温高速离心机，德国Eppendorf 公司产品。

1.2 豆浆的制备

称取50 g 黄豆，蒸馏水清洗3 次后，250 mL 蒸馏水室温下浸泡16 h。将浸泡后黄豆，豆液比按照1∶9 的比例加水后，用高速破壁调理机粉碎打浆3 min，打浆完成后，用100 目双层尼龙布过滤，倒掉豆渣，过滤后的豆浆即为生豆浆。

1.3 大豆多肽测定

于波长238 nm处蛋白质溶液吸光度的大小与肽键的数量呈正比[9]。分别配制质量浓度为50～300 μg/mL的标准溶液，以蒸馏水作为空白对照，于波长238 nm处测定不同浓度的吸光度，绘制标准曲线。所得多肽标准拟合方程为Y=0.001 48X-0.059 47，R2=0.998。样品中多肽的测定：取均质样品2 mL 添加2 mL 10%（W/V） 三氯乙酸溶液，充分混匀后静置15 min沉淀蛋白，以转速3 500 r/min 离心10 min，取上清于波长238 nm 处测定样品的吸光度，确定样品多肽质量浓度。

1.4 粉碎打浆工艺对大豆蛋白的影响

将浸泡后的黄豆分为2 组，一组利用粉碎机进行粉碎处理，破碎后打浆。另一组直接进行打浆，打浆完成后，2 组均于室温下孵育3 h，离心，取上清液测定所需吸光度。利用SDS-PAGE 凝胶电泳分析蛋白条带，根据计算结果和电泳条带分析粉碎打浆工艺对大豆蛋白的影响。

1.5 浸泡工艺对大豆多肽的影响

为了探究打浆前柠檬酸浸泡大豆对豆浆中多肽质量浓度的影响，每组称取大豆各50 g，用去离子水浸泡清洗2 次，沥干水分后以豆液质量比为1∶5，使用0%，5%，10%，15%（W/W） 的柠檬酸溶液常温条件下浸泡15 h。浸泡后使用去离子水清洗3 次后，豆液比1∶9，打浆3 min，使用100 目尼龙滤布进行过滤，去除滤渣，得到生豆浆。以转速13 000 r/min离心5 min，取上层清液，用于多肽质量浓度测定和SDS-PAGE 表征蛋白水解的情况。

1.6 不同蛋白酶对大豆多肽的影响

用酪蛋白作为底物与蛋白酶反应后用三氯乙酸沉淀酶与蛋白，于波长280 nm 处利用紫外分光光度计测定，根据吸光度对木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶（食品级） 的酶活力进行计算。

1.6.1 木瓜蛋白酶对大豆多肽的影响

将1.2 所制备的豆浆分为4 等份，按照酶和底物之比为1 200，1 600，2 000，2 400 U/g 进行酶解，分别酶解4，5，6，7，8 h 后离心，取上清测定吸光度，按照标准曲线计算出结果。所得样品用于SDS-PAGE 凝胶电泳，根据计算结果和电泳条带分析木瓜蛋白酶对大豆多肽的影响。

1.6.2 碱性蛋白酶对大豆多肽的影响

操作步骤同1.6.2。

1.6.3 风味蛋白酶对大豆多肽的影响

操作步骤同1.6.2。

1.7 超低分子量蛋白质（3.3～20.1 kDa） 电泳

按表1 配置15.5%的分离胶及4%的浓缩胶，将30 μL 样品和10 μL 上样缓冲液混合后，于100 ℃下水浴加热3 min，冷却后以转速13 000 r/min 离心3 min 后上样电泳。电泳时，电泳槽放入4 ℃或冰水浴中，外槽加入阳极缓冲液，内槽加入阴极缓冲液，30 V 预电泳10 min，将样品加入点样孔后30 V 电泳1 h，100 V 电泳至溴酚蓝到达胶底部后停止电泳，考马斯亮蓝染色。由于超低分子量多肽（3 000 Da及以下） 极易从凝胶上浸出，因此染色及脱色时间不宜太长。

表1 Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝胶制备

Tris-Tricine-SDS-PAGE 凝胶制备见表1。

2 结果与分析

2.1 粉碎打浆对大豆多肽的影响

粉碎打浆与未粉碎打浆组SDS-PAGE 电泳图见图1。

图1 粉碎打浆与未粉碎打浆组SDS-PAGE 电泳图

由图1 可知，43 kDa 以上的电泳条带几乎一样，说明粉碎工艺对此分子量及之上蛋白质的分解效果很小。31～43 kDa 分子量之间的电泳条带看，粉碎后再打浆的豆浆电泳条带明显变淡，说明粉碎后此分子量间的蛋白部分分解。22 kDa 分子量附近经粉碎后的豆浆的电泳条带也明显变淡。粉碎打浆工艺对分子量在22～43 kDa 之间的蛋白有较强的分解效果。另外，根据对粉碎黄豆与未粉碎黄豆的蛋白质含量，粉碎后所得的豆浆蛋白质含量明显低于未粉碎豆浆所得黄豆，故粉碎工艺有助于大豆中蛋白的分解，导致大豆中多肽的增加。粉碎打浆后大豆多肽质量浓度为950 μg/mL，含量较低。

2.2 柠檬酸浸泡对大豆多肽的影响

柠檬酸浸泡对大豆多肽质量浓度的影响见图2。

图2 柠檬酸浸泡对大豆多肽质量浓度的影响

由图2 可知，当柠檬酸添加量为5%时，豆浆中多肽质量浓度最高，达到1 519.56 μg/mL。当添加量大于5%，随着柠檬酸添加量的提高，多肽质量浓度逐渐降低。可能由于过低的pH 值使大豆蛋白变性或促使大豆中的内源性肽酶失活无法分解大豆蛋白。

柠檬酸浸泡处理组SDS-PAGE 电泳图见图3。

图3 柠檬酸浸泡处理组SDS-PAGE 电泳图

由图3 可知，未添加柠檬酸处理的样品组含有较复杂的蛋白条带，浓度最高的蛋白分子量主要集中在66，43，31，22 kDa 附近。当柠檬酸添加量为5%时，豆浆体系中蛋白质几乎完全被分解，仅在50 kDa 和小于22 kDa 处有较浅的蛋白条带。这与多肽含量变化保持一致。当柠檬酸添加量达到10%时，分子量为97 kDa 和60 kDa 左右的大分子蛋白水解效果较差，但其他大于22 kDa 的蛋白均被水解。与5%相比，97.4 kDa 附近的条带出现；当柠檬酸添加量达到15%时，43～90 kDa 的范围中，出现较多的蛋白条带，与10%处理组相比条带更清晰，说明柠檬酸浓度过高导致的大豆内源性蛋白酶失活无法水解大豆蛋白。因此，选择5%的柠檬酸浸泡大豆，使后续豆浆体系中大分子蛋白充分水解为多肽和氨基酸。

2.3 不同蛋白酶对大豆多肽的影响

2.3.1 木瓜蛋白酶

木瓜蛋白酶对大豆多肽的影响见图4。

图4 木瓜蛋白酶对大豆多肽的影响

由图4 可知，随着酶解时间增加，豆浆中多肽质量浓度均增加。酶解4 h，用量为2 400 U/g 组的多肽质量浓度高于其他组，随着酶解时间的延长，多肽增长速率降低。酶解8 h 后，经过2 000 U/g 木瓜蛋白酶处理组的多肽质量浓度为1 538.36 μg/mL。

2.3.2 碱性蛋白酶

碱性蛋白酶对大豆多肽的影响见图5。

图5 碱性蛋白酶对大豆多肽的影响

由图5 可知，随着蛋白酶用量的增加，多肽质量浓度逐渐增多。同时，随着酶解时间延长，多肽质量浓度增加。酶解8 h，1 200，1 600，2 000，2 400 U/g碱性蛋白酶处理组的多肽质量浓度分别为1 309.79，1 319.79，1 384.08，1 455.5 μg/mL。

2.3.3 风味蛋白酶

风味蛋白酶对大豆多肽的影响见图6。

图6 风味蛋白酶对大豆多肽的影响

由图6 可知，多肽质量浓度随着酶解时间增加而增加，不同用量处理组的多肽质量浓度具有明显差异，当用量为2 400 U/g 时，豆浆中的多肽质量浓度为1 468.36 μg/mL，此数据稍低于2 000 U/g组（1 483.36 μg/mL），2 000 U/g 为风味蛋白酶较为合适的添加量。

2.4 不同蛋白酶的SDS-PAGE 图谱分析

不同蛋白酶处理组的SDS-PAGE 电泳图见图7。

图7 不同蛋白酶处理组的SDS-PAGE 电泳图

从电泳条带1，2，3 和4 可以看出，随着木瓜蛋白酶的用量增加，分子量31～66.2 kDa 的电泳条带颜色逐渐加深，木瓜蛋白酶可以将部分降解大分子蛋白；而分子量在22 kDa 之间的条带颜色变深，可能是木瓜蛋白酶本身分子量在23 kDa 之间，由于加酶量的增加，导致电泳条带22 kDa 左右的颜色加深。

电泳条带5，6，7 和8 表明随着碱性蛋白酶添加量的增加，电泳条带颜色逐渐明显变浅，在加酶量为1 200 U/g 时，可检测到66.2～97.4 kDa 的电泳条带，而酶用量达到1 600 U/g 时，这部分条带明显变淡，继续增加酶量，条带消失。分子量在43～66.2 kDa的条带同样随着加酶量的增加而逐渐减少，加酶量为2 400 U/g 时，条带消失。分子量为14.4～43 kDa的条带无明显变化。碱性蛋白酶对大豆分子量较大的蛋白水解情况较好。

从电泳条带9，10，11 和12 可以看出，随着风味蛋白酶用量的增加，大于43 kDa 的蛋白条带逐渐变淡，当风味蛋白酶添加量达到2 000 U/g 时，大于66.2 kDa 的蛋白条带消失被完全水解。同时，加酶量的变化对低于43 kDa 的蛋白条带无影响。说明风味蛋白酶作用于分子量较大的部分大豆蛋白。

2.5 不同蛋白酶的Tricine-SDS-PAGE 图谱分析

不同蛋白酶处理组的Tricine-SDS-PAGE 电泳图见图8。

图8 不同蛋白酶处理组的Tricine-SDS-PAGE 电泳图

木瓜蛋白酶处理组小分子蛋白种类较多，集中于14.4～20.1 kDa，此外随着木瓜蛋白酶用量的增加，大于20.1 kDa 的蛋白条带逐渐变浅。与木瓜蛋白酶相比，碱性蛋白酶对小分子蛋白的水解程度更深，条带较少且颜色较淡，仅在20.1 kDa 附近电泳条带较为清楚，而其他条带多集中在分子量为7.8 kDa 以下，可确定其多为多肽。此外，不同风味蛋白酶添加量的样品之间的电泳条带无明显差别。综上所述，碱性蛋白酶可以较高效率将大豆蛋白水解为多肽和氨基酸。

3 结论

比较不同处理工艺对大豆多肽形成的影响，结果表明，柠檬酸具有一定的水解大豆蛋白的能力，碱性蛋白酶水解大豆蛋白大小分布于43.0～66.2 kDa；粉碎打浆工艺对大豆蛋白分子量22～43 kDa 有较强分解效果，但对大豆多肽生成作用较小。2 000 U/g 碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶酶解大豆蛋白8 h 后，豆浆中大豆多肽质量浓度分别为1 384.08，1 538.36，1 483.36 μg/mL。制备大豆多肽工艺效率大小依次为木瓜蛋白酶、柠檬酸添加量、风味蛋白酶、碱性蛋白酶和粉碎打浆处理。