核桃过敏原成分PCR 方法的建立

吴玉双，杨 倩，黄淑迪，陈 艳，姬 华

（1. 石河子大学食品学院，新疆石河子 832000；2. 国家食品安全风险评估中心中国医学科学院创新单位（2019RU014 号），北京 100021）

在过去的20 年里，过敏反应和过敏反应的发生率在不同的国家都有所增加。在全世界范围内，有高达6%的儿童和2%的成年人是过敏患者，并且这个数据呈现出明显的上升趋势[1-3]。近年来，食品过敏成为影响食品安全的重要影响因素之一[4-6]。过敏患者通常是无法治愈的，对过敏患者的唯一“治疗”是从饮食中完全去除引发过敏的成分，因此过敏患者十分依赖加工食品的成分标签。所以，为了尽可能地避免过敏患者因误食而导致的过敏反应，我国与其他各国均采用将食品成分进行标示的方法[7]。核桃和其他坚果是最常引起严重过敏反应的食物，人们通常认为食用核桃是一种健康的饮食习惯，但是对核桃的过敏会导致严重危害甚至死亡。全球约有4.9%的人对核桃过敏[8]，15%的儿童是核桃过敏体质[9]。核桃过敏会引发机体产生一系列的过敏症状并对皮肤、呼吸道、消化道等造成伤害[10]，过敏反应不仅影响患者的身体健康，而且降低了他们的生活质量。然而，核桃在食品加工过程中被广泛使用，患者想要完全避免误食核桃过敏原是极其困难的，超过80%的受访者认为应强调成分列表中的可能过敏原，并描述过敏原含量[11]。由此可见，与之相关的核桃过敏原的检测方法是具有重大意义的，核桃过敏原的检测主要有酶联免疫吸附法（ELISA） 及聚合酶链反应（PCR） 2 种方法。Yano T 等人[12]利用传统PCR 的方法检测核桃过敏原，发现mat K 基因是是其基因组中特异性最强的基因。Linacero R 等人[13]在过敏原编码序列上设计新型引物，利用荧光定量PCR 方法检测食品中的核桃过敏原，检测限为2.5 pg 核桃DNA，与ELISA 分析比较，该方法在核桃的痕量检测中显示出更高的灵敏度和可靠性。PCR 法在复杂食品中过敏原的定量分析及物种鉴定方面，具有其他方法无法比拟的优点，这使PCR 方法在动植物源性食物过敏原检测方面，存在极大的优势，适合国际法规所要求的食品中痕量过敏原的检测原则[14]。

在所有核桃过敏原中研究最多的是英国核桃中的Juglans Jug r 1，一种2 S 白蛋白种子储存蛋白，是引起过敏反应最主要的一种过敏原，可溶于水和低浓度盐溶液[14]。Jug r 1 还是一种前体蛋白，可在生化反应中分裂为一个大亚基和一个小亚基S。通过对核桃DNA 的扩增，根据Jug r 1 设计出的3 对新型引物，旨在建立灵敏度高、特异性强的核桃PCR 检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 食品材料

黄豆、青豆、蚕豆、绿豆、红豆、巴旦木、榛子、夏威夷果、扁杏仁、开心果、葵花籽、碧根果、腰果、核桃、松子、鹰嘴豆、黑豆、花生，均购自石河子农贸市场。

1.1.2 设备

均质机；DNA 提取盒；分析天平，上海民桥精密科学仪器有限公司产品；数显恒温水浴锅；漩涡振荡器；凝胶成像系统，美国Bio-Rad 公司产品；小型台式高速离心机；PCR 仪，Techne 公司产品；电泳仪，北京市六一仪器厂产品；微量核酸定量仪。

1.1.3 试剂

巯基乙醇、氯仿、500 bp ladder DNA marker，光明试剂厂提供；天根植物基因组DNA 提取试剂盒，天根公司提供；高盐甘露醇琼脂，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司提供；2×premix Taq，北京博大恒泰生物技术有限公司提供；琼脂糖，北京索莱宝科技有限公司提供；50 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐EDTA；100 mmol/L Tris-HCl。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

提取样品DNA 需使用天根公司生产的天根植物DNA 提取盒，依据以下步骤依次操作：试验最开始先将27 μL 无水乙醇与13 μL 缓冲液GD 混合，60 μL无水乙醇与15 μL 漂洗液PW 混合，将二者混合均匀。将混合好的缓冲液GP1 65 ℃水浴加热，加热完毕，再加入0.1%的巯基乙醇，后取700 μL 的混合溶液于离心管中，继续水浴加热。取核桃仁100 mg，在液氮的降温下充分地碾磨，将研磨好的核桃粉末样品马上转移到装有缓冲液GP1 的离心管中，并迅速上下颠倒振荡混匀后，再于65 ℃下水浴，时间为20 min，加热过程中需要多次颠倒振荡离心管，使之充分混匀。混匀后再加入700 μL 氯仿，充分混匀，离心（转速12 000 r/min，时间10 min），将离心所得上清液收集到离心管中，再加入700 μL 缓冲液GP2，振荡混匀。混匀后移到收集管的吸附柱CB3 中，离心（转速12 000 r/min，时间30 s），离心结束后倒掉废液。向吸附柱CB3 中加入500 μL 缓冲液GD，离心（转速12 000 r/min，时间30 s），倒掉吸附管的液体，再将吸附柱CB3 放入无菌收集管中。向吸附柱CB3 中加入600 μL 漂洗液PW，离心（转速12 000 r/min，时间30 s），倒掉吸附管的液体，将吸附柱CB3 重新放入无菌收集管中，重复以上步骤2 次。将吸附柱CB3 置于室温下放置数分钟，丢掉收集管，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CB3 放入无菌离心管中，向吸附膜的中间部位滴加100 μL 洗脱缓冲液TE，尽量使洗脱液全部滴在吸附膜上，室温下放置5 min，离心（转速12 000 r/min，时间2 min），离心后将上清液收集到离心管中。为提高DNA 的收集率，将收集到的液体重新移入到上述吸附柱CB3 中，吸附柱套入新的离心管中，离心（转速12 000 r/min，时间2 min），离心后将上清液收集到离心管中[15]。用同样的方法提取红豆、黄豆、蚕豆、青豆、榛子、花生、绿豆、巴旦木、夏威夷果、扁杏仁、开心果、葵花籽、鹰嘴豆、碧根果、腰果、松子、黑豆的DNA。由于红豆、黄豆、绿豆、黑豆质地较硬，提取前用无菌水浸泡1 h，便于研磨。

1.2.2 引物的设计

阳性参考：根据不同物种具有各自特异的基因，从Genbank 数据库下载核桃的Jug r 1 的基因，利用Primer Premier 6 软件设计出3 组引物，设计并利用NCBI 网站初步监测引物的特异性。查找文献，利用2 对引物WAL-F/R（GATCTATATTGTTGGAAAATGTAGC/GGTTAGAATCATTAGTGGAAATCAG）[16]，Jur Primer-F/R（TTCAACGTGACCATCTCCCC/ACACGAGGATGTGCTTGCTA）[17]做阳性参考。

引物的设计：设计出3 对引物，Jur 1 Primer-F/R（CTGGAAGATAACTGGTGACTA/ATTAGCAAGACGAGGCATT） 158 bp；Jur 2 Primer-F/R（GACAACCAGCGGCAGCATT/GCACCATCTCCTCCATTTCCTC）145 bp；Jur 3 Primer-F/R（GGGTGAGGAAATGGAGGAGAT/GGATGTGC TTGCTAGTTGCTA） 199 bp。

1.2.3 各引物PCR 扩增条件优化

以核桃DNA 为模板，以1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，以确定3 对引物的各自最佳退火温度。

1.2.4 各引物PCR 反应体系优化

WAL：Taq DNA 聚合酶12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA 模板1 μL，添加灭菌蒸馏水10.5 μL；Jur Primer：Taq DNA 聚合酶22 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加灭菌蒸馏水74 μL；Jur 1 Primer：Taq DNA 聚合酶25 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加灭菌蒸馏水20 μL；Jur 2 Primer：Taq DNA 聚合酶23 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加灭菌蒸馏水20 μL；Jur 3 Primer：Taq DNA 聚合酶23 μL、上下游引物各1 μL、DNA 模板2 μL，添加灭菌蒸馏水20 μL。

PCR 扩增的反应条件见表1[18]。

表1 PCR 扩增的反应条件

1.2.5 特异性试验

用市面上常见的干果豆类：黄豆、青豆、蚕豆、绿豆、红豆、巴旦木、榛子、夏威夷果、扁杏仁、开心果、葵花籽、碧根果、腰果、核桃、松子、鹰嘴豆、黑豆、花生检测引物的特异性。

1.2.6 灵敏度试验

分别取10 g 的核桃、花生加入不同研钵，快速研磨成粉末状。制出含有0.01%，0.10%核桃成分的花生粉样品[15]。将稀释后的样品的DNA 进行PCR 扩增，并进行电泳。

2 结果与分析

2.1 样品DNA 提取效率

为避免利用天根植物DNA 提取盒提取的DNA出现假阴性，需经过检测以确定是否适合后续的PCR 检测。

样品DNA 的提取效率见表2。

表2 样品DNA 的提取效率

2.2 各引物PCR 扩增条件的确定

WAL 引物的最佳退火温度为64 ℃，Jur 引物的最佳退火温度为54 ℃，引物Jur 1 Primer，Jur 2 Primer，Jur 3 Primer 的最佳退火温度需要设置温度梯度确定[19]。

Jur 1 Primer 引物PCR 退火温度的确认见图1，Jur 2 Primer 引物PCR 退火温度的确认见图2，Jur 3 Primer 引物PCR 退火温度的确认见图3。

图1 Jur 1 Primer 引物PCR 退火温度的确认

图2 Jur 2 Primer 引物PCR 退火温度的确认

图3 Jur 3 Primer 引物PCR 退火温度的确认

由图1 ~图3 可知，最佳退火温度为：Jur 1 引物50.7 ℃，Jur 2 引物（64.0 ℃；Jur 3 引物64.0 ℃。

Jur 1 引物的Tm值为50 ℃，设置退火温度50~60 ℃，8 个梯度分别为A：60.0 ℃，B：59.2 ℃，C：58.0 ℃，D：56.1 ℃，E：53.8 ℃，F：51.9 ℃，G：50.7 ℃，H：50.0 ℃，如图1 所示。在图1 中，Jur 1 引物在50.7 ℃时，扩增出158 bp 大小的片段，且条带清晰没有拖带，故Jur 1 引物的最佳退火温度为50.7 ℃。

Jur 2 和Jur 3 引物的Tm值均为55 ℃，故均设置退火温度50~64 ℃，形成8 个梯度，分别为A：64.0 ℃，B：62.9 ℃，C：61.2 ℃，D：58.5 ℃，E：55.3 ℃，F：52.7 ℃，G：51.0 ℃，H：50.0 ℃，如图2 和图3 所示。在图2 中，Jur 2 引物在64.0 ℃时，扩增出145 bp大小的片段，且条带清晰没有拖带，故Jur 2 引物的最佳退火温度为64.0 ℃。在图3 中，Jur 3 引物在64.0 ℃时，扩增出199 bp 大小的条带，且条带清晰没有拖带，故Jur 3 引物的最佳退火温度为64.0 ℃。

2.3 引物的特异性检测

Jur 1 Primer 引物对常见富含蛋白质植物DNA 扩增的结果见图4，Jur 2 Primer 引物对常见富含蛋白质植物DNA 扩增的结果见图5，Jur 3 Primer 引物对常见富含蛋白质植物DNA 扩增的结果见图6。

图4 Jur 1 Primer 引物对常见富含蛋白质植物DNA 扩增的结果

图5 Jur 2 Primer 引物对常见富含蛋白质植物DNA 扩增的结果

图6 Jur 3 Primer 引物对常见富含蛋白质植物DNA 扩增的结果

由图4 ~图6 可知，3 对引物的特异性良好。在图4 中，Jur 1 引物只扩增出158 bp 大小的核桃DNA片段；同样的，在图5 和图6 中，Jur 2 引物和Jur 3引物也分别只扩增出145 bp 和199 bp 大小的核桃DNA 片段。结果表明，对引物是核桃基因组DNA 的特异性引物，且特异性良好。

2.4 PCR 灵敏度的检测

Jur 1 Primer 引物灵敏度检测结果见图7，Jur 2 Primer 引物灵敏度检测结果见图8，Jur 3 Primer 引物灵敏度检测结果见图9。

图7 Jur 1 Primer 引物灵敏度检测结果

图8 Jur 2 Primer 引物灵敏度检测结果

图9 Jur 3 Primer 引物灵敏度检测结果

在图7 中，Jur 1 引物只在100%核桃基因组、10%核桃+ 90%花生基因组以及0.1%核桃+ 99.9%花生基因组中扩增出158 bp 大小的DNA 片段，故Jur 1引物的核桃检测最低限为0.1%；同样的，在图8 中，Jur 2 引物只在100%核桃基因组、10%核桃+ 90%花生基因组以及0.1%核桃+ 99.9%花生基因组中扩增出145 bp 大小的DNA 片段，故Jur 2 引物的核桃检测最低限为0.1%；而在图9 中，Jur 3 引物在0.01%核桃+ 99.99%花生基因组中扩增出199 bp 大小的DNA 片段，故Jur 3 引物的核桃检测最低限为0.03%。3 对引物相比而言，Jur 3 的灵敏度更高，适合于精密检测。

3 结论

核桃过敏原的检测主要有ELISA、普通PCR 和荧光PCR 等3 种方法，但是与其他2 种方法相比，普通PCR 方法所用的仪器简单、操作方便、成本低，能够满足一般实验室的要求，除此之外还有结果准确、灵敏度高等优点。试验采用普通PCR 法，将核桃DNA 浓度进行梯度稀释，利用设计的3 对引物进行灵敏度试验，结果表明该方法灵敏度高，3 对引物的最低检测限可达0.01%（质量分数）；试验选择18 种常见的干果豆类，利用设计的3 对引物进行特异性试验，结果表明设计的3 对引物特异性强；最后，试验所设计的引物来源于核桃的特有过敏原基因Jur 1，可提高试验的准确度，有效避免试验的假阳性。以上数据均表明该试验建立的PCR 方法适用于食品中核桃成分的分析。

PCR 检测过程中，影响PCR 检测效果的因素有很多，其中DNA 的提取效率也是影响PCR 扩增效果的重要因素之一。此外，核桃中含有蛋白质、单宁、多糖、酚类及色素等次生代谢物质会影响Taq DNA聚合酶的活性，进而影响PCR 扩增的效果。以前曾用的多种核酸提取方法提取核桃的DNA，如SDS法、高盐低PH 法、CTAB 法和简易CTAB 法等，然而还是不能有效除去干扰物质，导致影响试验结果的准确性。为了保证试验的准确性和可靠性，采用试剂盒法提取核桃额DNA，避免的上述缺陷。但是试验所使用的PCR，又需要花费大量的时间，因此还需去探索更快速、灵敏、准确的方法，如荧光定量PCR、质谱法和表面等离子共振生物生物传感器等[19-20]。