闽江不同河段河蚬的形态学及遗传多样性比较分析

廖梦香

(福建省淡水水产研究所，福建 福州 350002)

河蚬(Corbiculafluminea)隶属于蚬科(Corbicu lidae)、蚬属(Corbicula)，俗称黄蚬、蚬子、沙喇、蝲仔、蟟仔，广泛分布于世界各地淡水、咸淡水水域，一般栖息于江、河、湖泊、沟渠的砂质、泥沙底部[1]。河蚬肉质鲜美、营养价值高，既有明目、通乳的作用，又有解酒护肝等功效[2]。除了供给国内消费市场外，鲜活河蚬还远销日本和韩国等地区。由于目前河蚬供给主要依赖野生资源，近年部分河流设置了禁捕和休渔期，导致河蚬供不应求，价格不断升高，加剧了市场对未禁捕区域野生河蚬的资源掠夺，造成严重的生态资源破坏。

线粒体DNA作为动物遗传学研究的理想分子标记，被广泛应用于水生生物的遗传多样性、物种分析和分子系统进化等方面。线粒体细胞色素b基因(Cytb)被广泛应用于鱼类群体遗传多样性研究[3-5]、种群遗传结构分析[6-8]和系统发育研究[9]等，也被用于洪泽湖和洞庭湖的河蚬种群遗传多样性研究[10-11]。另外线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ(COⅠ)基因和线粒体16S核糖体RNA(16S rRNA)基因也常被用于鱼类的仔稚鱼鉴定[12]、分子系统进化分析[13-14]、物种鉴定[15-16]、遗传多样性分析[17-18]和DNA条形码研究[19-21]，此外被广泛应用于贝类遗传多样性分析[22]、系统学研究[23]和种间鉴定[24]等，但在河蚬遗传多样性分析中尚未见报道。

河蚬作为溪流中常见的贝类之一，已受到广泛的关注和研究，已有的研究主要集中在生理生化[25]、营养成分[26-27]、繁殖生物学[28-30]、遗传多样性[31-32]和时空分布[33-35]等方面。福建闽江是我国河蚬的主要产区之一，由于闽江水质和沙质都很好，因此河蚬特别肥厚鲜美，目前针对闽江流域河蚬的研究仅限于多环芳烃和有机氯农药的富集等研究[36]，而关于其形态学和遗传多样性研究未见报道。因此，通过线粒体COⅠ、Cytb和16S rRNA基因探索闽江6个河段河蚬群体的遗传多样性及进化速度，对于推进闽江河蚬资源的保护和开发利用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

分别从闽江的延平河段(Yanping，YP)、闽侯河段(Minhou，MH)、龙祥岛河段(Longxiangdao，LXD)、马尾河段(Mawei，MW)、长乐河段(Changle，CL)和连江河段(Lianjiang，LJ)随机采集30个试验用蚬，共180个个体，采集地点如图1所示。采集到的河蚬样本保存于-20℃冰箱中备用。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学性状测量

随机选取闽江6个河段河蚬群体样品共180个，每个河段30个，用纸巾将河蚬贝壳表面的水分吸干后，使用游标卡尺测量壳长(Shell length，SL)、壳高(Shell height，SH)和壳宽(Shell width，SW)，精确到0.01 mm。使用电子天平测量总重(Toll weight，TW)、壳重(Shell weight，SW)和软体重(Soft body weight，SBW)，精确到0.01 g。河蚬的外形见图2。

1.2.2 基因组DNA提取

参照TIANamp Marine Animals DNA Kit试剂盒说明书(TIANGEN)的提取方法，每个河段随机选取12个河蚬斧足组织进行DNA提取。将提取到的72个DNA样品进行1%琼脂糖凝胶电泳和纯度检测。

1.2.3 引物合成

从NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查找河蚬COⅠ、Cytb和16S rRNA序列，使用Primer Premier 6分别设计COⅠ、Cytb和16S rRNA序列引物(表1)，送至福州擎科生物技术有限公司进行合成。

表1 引物信息

1.2.4 COⅠ、Cytb和16S rRNA基因片段的PCR扩增和测序

COⅠ、Cytb和16S rRNA基因片段的PCR扩增反应体系为 40 μL：Premix TaqTM(TaKaRa)20 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板2 μL、去离子水16 μL，扩增程序如表2所示。将PCR产物进行1%凝胶电泳，选取条带单一且符合预期大小片段的PCR产物，送至福州擎科生物技术有限公司进行双末端测序。

表2 PCR扩增程序

1.3 数据分析

使用Excel 2007对形态学数据进行初步计算变异系数，再采用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析和显著性分析，P<0.05表示组间差异显著。使用Mega 7软件Clustal W进行多序列比对，人工校对和计算闽江6个不同河段河蚬群体的COⅠ、Cytb和16S rRNA基因片段序列长度和碱基组成。使用Dnasp 5软件计算闽江6个河段河蚬群体COⅠ、Cytb和16S rRNA基因的遗传多样性。使用Mega 7软件的最大似然法(Maximum likelihood，ML)和邻接法(Neighbor-joining，N-J)构建闽江6个河段河蚬群体COⅠ、Cytb和16S rRNA基因片段序列分子系统进化树。通过中性检验Tajima’sD、Fu’sFs和核苷酸不配对分布图来检测闽江河蚬的群体历史动态。

2 结果与分析

2.1 闽江6个河段河蚬形态学性状分析

闽江6个河段河蚬的形态学性状统计量见表3。不同河段河蚬壳长、壳高和壳宽的变异系数较小，而软体重、壳重和总重的变异系数较大，其中软体重、壳重和总重变异系数最大的群体分别为LJ(53.30%)、MW(48.82%)和MW(49.82%)。LXD群体的壳高/壳长显著高于YP、MW和CL(P<0.05)，与MH和LJ的差异不显著(P>0.05)。LJ群体的壳宽/壳长极显著高于YP、MH、LXD、MW(P<0.01)，与CL的差异不显著(P>0.05)。MW和LJ群体的软体重/总重均极显著高于YP、MH、LXD、CL(P<0.01)，MW和LJ之间的差异不显著(P>0.05)。LJ群体的壳重/总重极显著高于YP、MH和MW(P<0.01)，显著高于CL(P<0.05)，与LXD的差异不显著(P>0.05)。

表3 闽江6个河段河蚬群体的形态学性状统计量(n=180)

2.2 闽江6个河段河蚬群体COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因的碱基组成

采集闽江6个河段河蚬群体共72个样品进行线粒体CO Ⅰ、Cytb和16S rRNA基因PCR扩增、测序和分析。使用MEGA7.0对COⅠ、Cytb和16S rRNA基因序列进行比对、人工校对和剪切后，分别获得444、466、364 bp的序列片段。COⅠ基因中A、C、T和G四种碱基的平均含量分别为32.3%、16.9%、33.5%和17.3%，A+T和C+G的含量分别为65.8%和34.2%；Cytb基因中A、C、T和G四种碱基的平均含量分别为39.3%、16.0%、32.1%和12.6%，A+T和C+G含量分别为71.4%和28.6%；16S rRNA基因A、C、T和G 4种碱基的平均含量分别为34.6%、15.2%、34.4%和15.7%，A+T和C+G的含量分别为69.1%和30.9%(表4)。闽江6个河段河蚬种群的COⅠ、Cytb和16S rRNA基因碱基组成基本一致。

表4 闽江6个河段河蚬群体COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因碱基组成

2.3 闽江6个河段河蚬群体COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因的的遗传多样性

在COⅠ基因的72条序列中检出20种单倍型即Hap1～Hap20，其中Hap5为YP独享单倍型，Hap6～Hap9为LXD独享单倍型，Hap10～Hap14和Hap16均为MW独享单倍型，Hap17～Hap18为CL独享单倍型，Hap19～Hap20为LJ独享单倍型，其余均为共享型单倍型，如表5所示。6个河段群体的单倍型数量：MW>CL>LXD>YP >LJ >MH，其中Hap3在6个河段群体中分布最多，占比为31.9%(23/72)。在Cytb基因的71条序列中检出20种单倍型即Ha1～Ha20，其中Ha1、Ha3为YP独享单倍型，Ha8～Ha10为LXD独享单倍型，Ha11～Ha15为MW独享单倍型，Ha16～Ha20为LJ独享单倍型，其余均为共享型单倍型，如表5所示。6个河段群体的单倍型数量：LJ>MW>YP/LXD>CL>MH，其中Ha6在6个河段群体中分布最多，占比为25.4%(18/71)。在16S rRNA基因71条序列中检出9种单倍型即H1～H9，其中H5～H7为LXD独享单倍型，H8～H9为MW独享单倍型，其余均为共享型单倍型，如表5所示。6个河段群体的单倍型数量：LXD>MW/LJ>YP /MH/CL，其中H2在6个河段群体中分布最多，占比为28.2%(20/71)。

表5 闽江6个河段河蚬群体COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因单倍型分布

续表5

在COⅠ、Cytb和16S rRNA基因中河蚬总的单倍型多样性、核苷酸多样性及平均核苷酸差异数分别为(0.840±0.030)、(0.313±0.008)、136.010，(0.892±0.021)、(0.230±0.001)、98.330和(0.800±0.019)、(0.316±0.009)、108.212(表6)。在COⅠ、Cytb和16S rRNA基因中单倍型多样性(Hd)最高的群体分别为MW群体、LJ群体和LJ群体，最低的群体分别为MH群体、MH群体和YP群体；核苷酸多样性(π)最高的群体分别为MW群体、LJ群体和LJ群体，最低的群体分别是YP群体、MW群体和YP群体。

表6 闽江6个河段河蚬群体COⅠ、Cyt b和16S rRNA基因的遗传多样性

2.4 闽江6个不同河段河蚬群体系统进化树

通过ML法和N-J法建立COⅠ、Cytb和16S rRNA基因系统进化树，以硬壳蛤(Mercenariamercenaria)作为外类群，bootstrap 1 000。在COⅠ基因ML和N-J系统进化树中均显示，11个单倍型(38个个体)聚为一支，置信度分别为89和94，主要分布在MH、LXD、CL、LJ、MW；9个单倍型(34个个体)聚为另一支，主要分布在YP；20个单倍型聚为一大支后再与硬壳蛤相聚(图3)，表明闽江河蚬有2个种且能与硬壳蛤区分开。在Cytb基因ML和N-J系统进化树中均显示，14个单倍型(49个个体)聚为一支，置信度分别为100和99，主要分布在MW、LJ、CL、LXD、MH；其他6个单倍型(22个个体)与硬壳蛤聚为另一支，主要分布在YP(图4)。在16S rRNA基因ML和N-J系统进化树中均显示，5个单倍体(34个个体)聚为一支，置信度分别为100和99，主要分布在MH、LXD、CL、LJ；另4个单倍体(37个个体)与硬壳蛤聚为另一支，主要分布在YP、MW、CL、LJ(图5)。表明闽江河蚬线粒体基因的进化速度为COⅠ>Cytb > 16S rRNA。

2.5 闽江6个河段河蚬群体历史动态

闽江6个河段河蚬群体COⅠ基因的中性检验Tajima’sD值在1.933～2.831之间，其中YP群体差异不显著(P>0.05)，其余差异极显著(P<0.01)；Fu’sFs值为10.597～37.394，差异均极显著(P<0.01)。Cytb基因的中性检验Tajima’sD值在-0.395～2.183之间，其中YP群体和CL群体为负值，其余均为正值；MH群体和LJ群体差异显著(P<0.05)，其余差异不显著(P>0.05)；Fu’sFs值在0.303～34.509之间，其中只有MW群体差异不显著(P>0.05)，其余均差异极显著(P<0.01)。16S rRNA基因的中性检验Tajima’sD值在2.182～3.042之间，其中YP群体差异显著(P<0.05)，其余差异极显著(P<0.01)；Fu’sFs值在17.796～35.355之间，差异均极显著(P<0.01)，详见表7。该3个基因的岐点分布图均呈多峰型(图6～图8)。以上均表明闽江河蚬群体很稳定，均未发生过大规模的种群扩张等历史事件。

表7 闽江6个不同河段河蚬COⅠ、Cyt b 和16S rRNA基因的中性检验

3 讨论

3.1 形态学差异分析

环境是影响双壳类动物个体差异的主要原因之一，虽然河蚬具有因栖息地环境变化而形成高度形态变异的特性，但是已有的研究表明形态差异很难被用于区分不同河段的河蚬[37-39]。本研究分析了闽江6个河段河蚬群体的形态学数据，结果表明壳长、壳高和壳宽的变异系数较小，而软体重、壳重和总重的变异系数较大，其中软体重的变异系数最大，为53.30%，这与学者对凹线仙女蚬(Cyrenobatissasubsulcata)[37]、波纹巴菲蛤(Paphiaundulata)[40]和红树蚬(Polymesodaerosa)[41]的研究结果相一致。综合对比壳高/壳长(LXD>MH>LJ>YP/MW/CL)、壳宽/壳长(LJ>CL>MH>LXD>YP/MW)、软体重/总重(MW>LJ>YP/LXD/CL>MH)和壳重/总重(LJ>LXD/CL>MH>YP/MW)的数据，可以看出YP和MW群体的壳高/壳长、壳宽/壳长和壳重/总重均最小，但MW群体的软体重/总重最大，YP群体的软体重/总重居中；表明闽江6个河段的河蚬在形态上无显著性差异，因此无法通过形态学数据区分闽江不同河段的河蚬。

3.2 遗传多样性与进化速度比较分析

本研究综合分析了闽江6个河段河蚬群体的COⅠ(444 bp)、Cytb(466 bp)和16S rRNA(364 bp)基因部分序列片段，3个基因中A+T含量(65.8%、71.4%和69.1%)明显高于C+G的含量(34.2%、28.6%和30.9%)。捞刀河和洪泽湖河蚬的线粒体COⅠ基因序列中发现A+T的含量(64.3%和65.0%)高于C+G的含量(35.7%和35.0%)[32，42]，且洞庭湖河蚬线粒体Cytb基因部分序列中也发现A+T的含量(70.4%)明显高于C+G的含量(29.6%)[11]，表明了COⅠ和Cytb基因序列在不同地域的河蚬中具有可比性。16S rRNA基因在其他贝类中也有相似的结果，闫永斌等[22]在日本镜蛤(Dosiniajaponica)、四角蛤蜊(Mactraveneriformis)、中国蛤蜊(Mactrachinensis)和西施舌(Coelomactraantiquata)中发现A+T (67.11%、61.35%、59.30%和60.59%)含量高于C+G (32.89%、38.65%、40.70%和39.41%)；陈丽梅等[23]在大竹蛏(Solengrandis)、长竹蛏(Solenstrictus)和小刀蛏(Cultellusattenuatus)中发现A+T (60.8%、62.3%和62.5%)的含量高于C+G (39.2%、37.7%和37.5%)的含量；孙超等[24]在光滑河蓝蛤(Potamocorbulalaevis)、黑龙江河蓝蛤(P.amurensis)、焦河蓝蛤(P.ustulata)河红肉河蓝蛤(P.rubromuscula)中也发现A+T (61.48%、61.48%、61.53%和61.10%)的含量高于C+G (38.52%、38.52%、38.46%和38.90%)的含量。可见(A+T)%含量高于(C+G)%是许多双壳类动物线粒体碱基组成的共性。

单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(π)是评价生物遗传多样性的两个重要指标[43]。本研究发现，闽江6个河段河蚬群体COⅠ和Cytb基因的单倍型数量和多样性均大于16S rRNA基因，可见COⅠ和Cytb基因的单倍型多样性比16S rRNA基因高。COⅠ、Cytb和16S rRNA基因核苷酸多样性差异不大。以上都表明了COⅠ和Cytb基因比16S rRNA基因遗传多样性更高。

根据系统进化树可以看出，COⅠ基因的ML树和N-J树能明显区分闽江6个河段河蚬群体20种单倍型与硬壳蛤的亲缘关系；而Cytb(20种单倍型)和16S rRNA(9种单倍型)基因ML树和N-J树均无法完全区分他们之间的亲缘关系；表明该3个基因片段的进化速度为COⅠ>Cytb>16S rRNA。在4种贝类、3种蛏类和4种河蓝蛤的研究中也均出现了COⅠ基因比16S rRNA基因的进化速度更快的结果[22-24]，本研究再一次证明，在双壳类动物线粒体基因中COⅠ进化速度快于16S rRNA基因。

3.3 群体历史动态分析

中性检验和核苷酸不配对分布图是检验种群历史动态的两种方法。在中性检验中，若Tajima’sD值和Fu’sFs值均为正值，表明种群趋于稳定，若Tajima’sD值为负，且统计学上达到显著水平，表明该群体偏离中性突变理论模型，有可能受到过选择压力、瓶颈效应的作用或者发生过大规模的群体扩张[44-45]。闽江6个河段河蚬群体COⅠ和16S rRNA基因的中性检验Tajima’sD值和Fu’sFs值均为正值。Cytb基因Tajima’sD值中YP群体和CL群体为负值，但统计学上差异不显著(P>0.05)；Fu’sFs检验中6个河蚬群体Fs值均大于零。若核苷酸岐点分布图呈现多峰型，则表明种群呈稳定状态，反之，若呈单峰型，则表明种群历史有扩张现象[31]。闽江6个河段河蚬群体的核苷酸岐点分布图均呈多峰型。以上均表明了闽江河蚬群体很稳定，均未发生过大规模的种群扩张等历史事件。

4 结论

本研究综合分析了闽江6个河段河蚬群体形态学数据和线粒体CO Ⅰ(444 bp)、Cytb(466 bp)和16S rRNA基因(364 bp)部分序列片段。壳长、壳高和壳宽的变异系数较小，而软体重、壳重和总重的变异系数较大，其中软体重的变异系数最大的群体为LJ(53.30%)。在COⅠ、Cytb和16S rRNA基因中A+T含量相近且明显高于C+G的含量；COⅠ和Cytb 基因的单倍型数量明显多于16S rRNA基因；COⅠ和Cytb基因的遗传多样性比16S rRNA基因高；进化速度是COⅠ>Cytb>16S rRNA基因。COⅠ、Cytb和16S rRNA基因的中性检验和岐点分布图均表明了闽江河蚬群体很稳定。综上所述，闽江6个河段河蚬群体的COⅠ、Cytb基因比16S rRNA基因遗传多样性更高、进化速度更快，即使分化出独立的遗传群体，也未发生过大规模的种群扩张等历史事件，可以作为一个整体进行保护和开发应用。