激素刺激降香黄檀心材类物质形成分析

何文杰 张 赛 祝远静 李佳文 杨 云 孟 慧

（1.中国医学科学院 北京 100193；2.北京协和医学院/药用植物研究所海南分所/海南省南药资源保护与开发重点实验室 海南万宁 571533）

降香黄檀（Dalbergia odorifera T.Chen）是海南特有的珍稀濒危树种， 茎干和根部干燥心材为名贵中药材“降香”，其性味辛、温，兼有行气活血、止痛止血功效[1-3]。 降香黄檀在自然条件下成材极缓慢，主干分枝较多，直立挺拔者少，一般种植7～10 年才开始形成心材，30～40 年方可成材， 且相同树龄的降香黄檀心材直径和含油量差异也较大。

随着植物次生代谢物形成和积累研究发现，次生代谢物产生与激素胁迫等相关，人们在研究心边材时也发现心材形成与激素相关，Shigo L.和Hillis W.E.[4]早在1973 年就发现乙烯利促进辐射松心材内多酚成分的产生；Davison 和Young[5]研究苹果树、桃树、枫树、 柳树等树木边材时发现其内含有一定量的脱落酸；张仲伟等[6]研究土鲁香割脂试验时，采用乙烯利处理后采收香脂， 发现处理后比火烙刺激及对照更快结香， 证明树脂产生速度与刺激物及温度等外界因素呈正相关；林励等[7]研究发现激素及风害等外界刺激能促使檀香心材形成；林奇艺等[8]对几种激素刺激檀香心材形成研究发现，2%乙烯利对心材的形成及挥发油含量有促进作用。 在生物力学、水力学[9]及分子生物学[10]等方向研究心材形成也获得较大突破，均发现心材的形成与激素相关，认为木质部边材向心材转变的过程中， 有一种或几种激素类物质发挥着关键作用，是树木的一个发育过程，而不是由木薄壁细胞死亡引起的[11]，只是心材形成后的一个结果[12-14]。

为了阐述上述问题， 本研究主要针对心材发育特点，开展外施激素和物理伤害等手段，筛选促进心材形成的诱导因子，以探索加速心材形成的方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物材料 选取3 龄尚未形成心材的降香黄檀幼树为试验样品，30 龄降香黄檀树边材为阴性对照，均种植在兴隆南药园实验地，长势良好；天然降香黄檀茎干部心材为标准品，依据2020 版《中国药典》鉴定为正品。

1.1.2 仪器 AO860 滑走切片机、KH-3000 型薄层色谱扫描仪、GOODLOOK-1000 型薄层色谱成像系统、SP-II 型薄层电动点样器。

1.1.3 试剂 降香挥发油对照品购于中国药品生物制品检定所，批号为111579-200201；激素购于SIGMA 公司；其他化学试剂为国产分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 激素筛选 设3 种激素（乙烯利、赤霉素、水杨酸）、3 种剂量（1%、2%、4%）、3 种施药方法（刮皮法：为茎干刮去表皮，涂药封口；砍伤法：为茎干砍伤至木质部，涂药封口；钻洞法：为茎干钻洞，药液注入洞中）进行处理，并设蒸馏水为对照、不处理正常植株为空白对照。 共31 个处理， 每个处理6 株树，共3 次重复；每年施药4 次，连续处理1 年。 心材形成观察： 施药前及施药后定期于原处理处观察木材颜色变化，处理后截取伤口至上方20 cm 处茎干，观察木材色泽、气味、木材显微特征、导管堵塞率。

1.2.2 薄层色谱分析

（1）样品溶液制备：取上述人工样品各2.0 g，加乙醚20 mL， 置水浴上加热回流25 min（水温设置为42℃），过滤，滤液用旋转蒸发仪除去乙醚后加无水乙醇定容于5 mL 容量瓶内，待用。

（2）对照品溶液制备：取天然降香心材粉末及边材粉末各2.0 g，方法同上。

（3）橙花叔醇溶液制备：橙花叔醇标准品与无水乙醇按1∶10 的体积比配成溶液，待用。

（4）显色剂香草醛硫酸溶液制备：香兰素1 g 与浓硫酸100 mL 配成香草醛硫酸溶液，再与无水乙醇按1∶9 的比例配成混合溶液，待用。

按照2020 年版《中国药典》中介绍的降香薄层色谱鉴定法，用微量进样器分别吸取人工样品溶液、对照品溶液、橙花叔醇溶液各30 μL，点于同一块硅胶G 薄层板上（20 cm×20 cm），点样直径为1～2 mm，以甲苯-乙醚-氯仿（7∶2∶3.5）为展开剂，展开，取出，晾干，通过薄层色谱成像系统分别在254 nm 和365 nm的光源下成像观察。

2 结果与分析

2.1 不同激素间诱导效果比较

比较3 种激素处理方法， 其中刮伤树皮涂抹激素后木材颜色没变化，说明心材的形成主要与木质部相关， 而砍伤涂抹激素和钻洞注射激素的处理方法均诱导形成变色木材，且钻洞注射效果更佳（图1）。同时对比乙烯利、赤霉素、水杨酸3 种激素诱导心材的形成效果， 乙烯利处理的影响范围及强度明显大于赤霉素、水杨酸和蒸馏水对照，处理1 个月后木材颜色发生变化，6 个月后伤口纵向形成红褐色至紫红色的变色木材。 从导管堵塞率看（表1），诱导面积最广，平均延伸距离在14 cm 以上，且燃烧时有中药降香气味；赤霉素处理组在洞口处诱导效果最好，但延伸距离短；水杨酸处理组在0～5 cm 范围内导管堵塞率与乙烯处理组类似， 但变色木材颜色为灰黑色坏死状，经检测其阻塞物质不同于其他处理组；蒸馏水对照株仅伤口处形成浅黄色的少量变色木材。 随着激素浓度升高对植物营养生长抑制作用明显加大，激素4%浓度时3 龄降香黄檀均出现落叶现象，仅1%浓度处理的树木能正常生长。

表1 1%浓度激素处理后导管堵塞率

图1 不同激素诱导效果

2.2 天然心材与诱导心材宏观比较

通过降香黄檀道地产区的走访调查和栽培过程观察可知，正常生长的降香黄檀树7～10 龄开始形成心材，之后植株生长即变得极其缓慢。30 龄左右的降香黄檀树，心边材比例为1∶4（图2 A）；降香黄檀树受到机械创伤或虫蛀，会在创伤面、虫道周围形成心材类物质 （图2 B 是断枝后伤口受到虫蛀形成的心材类物质， 图2 C 是外施乙烯利6 个月观察到心材类物质产生）。

图2 降香黄檀天然心材与诱导心材形成情况

2.3 天然心材与乙烯利后木材显微特征观察

在光学显微镜下观察30 龄降香黄檀心材和乙烯利处理3 龄降香黄檀变色木材显微切片， 发现处理后变色木材中部分导管及周围薄壁细胞被红褐色至紫褐色的心材类物质填充， 其显微特征与天然心材相同（图3）。

图3 降香黄檀木材显微结构

2.4 薄层色谱鉴定

采用GOODLOOK-1000 型薄层色谱成像系统对图4 中各样品的RF 值进行相似度比对，发现经过激素处理样品中都含有标准品（降香挥发油）中所有的点外，还含有一个特有的浅紫色点；蒸馏水对照也有该点，且比标准品少一个粉红点；根部心材比标准品少一个红点； 降香黄檀边材没有相应的点。 各点的RF 值见表2。

表2 薄层色谱图各点RF 值

图4 薄层色谱图

4 讨论与结论

乙烯作为一种植物胁迫的信号传导分子， 已有众多诱导心材形成的研究报道。 乙烯利促进降香黄檀心材形成的研究发现， 各种植物激素诱导6～7 龄左右降香黄檀树，乙烯利诱导心材比例最大[15-16]；且乙烯利处理诱导合成心材物质种类最全、 含量最高且最接近自然心材[17]，其中4%[15]、2%[16，18]、0.5%[19]的乙烯利均能有效诱导降香黄檀心材的形成。

本研究发现，2～3 龄降香黄檀幼树即可被乙烯利诱导形成心材类物质， 且乙烯利的影响范围和强度都明显大于赤霉素、水杨酸。 在对激素处理的样品进行分析时发现， 其心材类物质积累的显微结构与天然心材一致， 仅薄层色谱分析发现处理组样品含有一个特殊点。 差异可能来源于：①人工样品选取的是尚未形成心材的降香黄檀幼树， 而天然心材样品来源于数十年以上的大树， 不同树龄的树木代谢物存在一定差异； ②天然心材样品来源于木材加工的边角料，从心材经过了漫长的时间及加工储藏过程，会造成部分次生代谢产物发生变化， 而处理组样品来源于3 龄幼树激素处理（1 年后又经低温干燥）。后续也对样品进行GC-MS 气质联用分析，各种激素诱导后的产物均比天然心材复杂，成分聚类发现乙烯利处理后产生的心材类物质与天然降香主要成分相似度最高在96%以上（数据未发表）。 研究表明，当降香黄檀树体受到生物或非生物胁迫时，均会启动心材的形成，且心材的形成与乙烯信号相关。 乙烯利诱导降香黄檀心材效果最佳，具有很好的开发前景，但诱导心材是否可以替代天然心材得以产业化应用， 还需从成分、药效及产量质量上进行综合评估。