基于RhoA/ROCK通路探究复方中药对腹水综合征肉鸡肝纤维化的影响

王慧敏，崔 亮，韩宇峰，张 剑，王珂瑶，邓瑞强，康 杰，郭东清，段智变

（山西农业大学动物医学学院，山西 太谷 030801）

肉鸡腹水综合征（Ascites syndrome，AS）是一种营养代谢疾病，由遗传、缺氧、低温、营养等多因素引起，4~5周龄肉鸡多发，严重影响养禽业经济发展[1]。肺动脉高压是AS主要发病机理[1]，持续肺动脉高压导致肝纤维化发生[2]。研究AS 肝纤维化发病机理及相关防治药物具有重要意义。

Rho/ROCK 通路通过介导下游因子调控细胞迁移、凋亡、增殖等功能，参与多种生理病理过程，在肺动脉高压和肝纤维化形成发病机制中，Rho/ROCK通路发挥关键作用[3-4]。Ras同源基因家族成员A（Ras homolog gene family member A，RhoA）、Rho 相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated oiled coil forming protein kinase，ROCK）、肌球蛋白轻链磷酸酶（Myosin light chain phosphatase，ML⁃CP）、MLCP 调节亚基（Myosin-phosphatase target⁃ing subunit 1，MYPT1）和磷酸化的肌球蛋白轻链（Phosphorylated myosin light chain，P-MLC）是RhoA/ROCK通路核心因子。

顾庆云、韩博等研究发现，复方中草药和L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）均可有效防治AS[5-6]。本课题组前期研究，由黄芪、丹参、当归、茯苓等组成的自拟复方中药水提液和L-Arg通过抑制肝纤维化而有效防治AS[7]。本试验研究RhoA/ROCK通路在AS 肉鸡肝纤维化中损伤机理及自拟复方中药水提液和L-Arg 作用机制，为AS 发病机制和有效防治药物提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及仪器

分期配合饲料购自山西大象农牧集团，黄芪、当归、茯苓、丹参等均购自山西省太谷县药材公司，RNAiso Plus 试剂盒、SYBR Prime ScripTMRT Reagent Kit（TaKaRa，日本），ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix（诺唯赞，南京），RhoA、ROCK、MLCP、P-MLC ELISA 试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司。

光学显微镜（Olympus，BX51TF 型），核酸蛋白浓度测定仪（NanoDrop，ND-1000）。

1.2 试验动物及分组

以分期配合饲料作为基础日粮，100 羽1 日龄罗斯肉鸡常规喂养7日后，随机分为5组：空白对照组（K 组）、AS 模型对照组（M 组）、复方中药水提液高剂量组（G 组）、复方中药水提液低剂量组（D 组）和L-Arg 对照组（L-Arg 组）。K 组常规饲养，M 组与G、D 组及L-Arg 组以低温（9~11 ℃）、高能（日粮添加3%猪油与4%鱼粉）、高盐（饮水添加0.12%NaCl）多因素法复制AS 模型[8]，同时，G、D组中饮水添加2.0、1.0 mL·kg-1·bw·d复方中药水提液，L-Arg 组中饲料给予1% L-Arg。试验期为28 d。具体见表1。

表1 试验分组和饲养方式Table 1 Groups and breeding ways

分别于15、25、35日龄随机选取各组肉鸡5羽，称重，观察整体状态，尤其是AS 特征症状，并作剖检观察。取35 日龄心脏，除去表面血凝块及脂肪，分离全心室和右心室并分别称重，测定腹水心脏指数（Ascitesheartindex，AHI），以AHI>0.250作为标准，判断AS发生[9]。

AHI=右心室重量/全心室重量（RV/TV）。

采集各组35日龄肉鸡肝左叶用4%多聚甲醛固定，观察肝脏形态，右叶用-80 ℃液氮冷冻，用于测定RhoA、ROCK、MLCP、MYPT1、P-MLC 等RhoA/ROCK通路相关因子。

1.3 复方中药水提液制备

黄芪、丹参、当归、茯苓=3∶2∶2∶2 配比，汤剂采用水煎法制备：水浸30 min→武火煮沸→文火40 min→滤3 层纱布3 次→滤液3 次→减压蒸馏浓缩成1 g·mL-1汤剂。-20 ℃保存，加热后混合供料。

1.4 方法

1.4.1 Masson染色法观察肝纤维化

常规方法制备石蜡切片5 μm，二甲苯和梯度酒精脱蜡水化→Weigert 铁苏木素染色10 min→酸性乙醇适度分化→水洗后Masson 蓝化液返蓝→浸入蒸馏水→丽春红品红染色7 min→弱酸液和磷钼酸溶液分别洗1 min→苯胺蓝染液染色5 min→浸入弱酸→95%乙醇和无水乙醇快速脱水→透明封片。于光学显微镜下观察胶原纤维沉积变化。

1.4.2 实时荧光定量PCR 检测肝脏MYPT1 mRNA相对表达量

使用RNAiso Plus 试剂盒说明书提取肝脏总RNA，无菌无酶水溶解后用核酸蛋白浓度测定仪测定浓度并调整浓度为1 μg·μL-1，OD260/OD280和OD260/OD230确 定RNA 纯 度。 采 用SYBR Prime ScripTM RT Reagent Kit 反转录为cDNA，以ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 作实时荧光定量PCR 检测。参照NCBI 中Gallus 相关基因CDS 序列设计并合成引物，引物具体信息见表2。PCR反应体系：上下游引物（10 μmol·L-1）分别为0.2 μL、cDNA 1.0 μL、ChamQ Universal SYBR Qpcr Master Mix 5 μL 及ddH2O 补至10 μL，反应条件：95 ℃30 s→95 ℃5 s→60 ℃30 s，循环40 次。2-∆∆Ct法计算MYPT1 mRNA相对表达量。

表2 引物序列、退火温度及PCR产物长度Table 2 Primer sequence,annealing temperature,and PCR product length

1.4.3 ELISA 测定肝脏RhoA、ROCK、MLCP、PMLC蛋白含量

肝脏（0.1~0.2 g）冷生理盐水中洗净→干燥→称重→按质量体积比1∶9 添加生理盐水→冰水浴均质→5 000 r·min-1，5 min→取上清液→稀释混匀备用。肉鸡肝脏RhoA、ROCK、MLCP、P-MLC 含量采用ELISA法测定。

1.5 数据处理与分析

采用Graph Pad Prism 8 软件对数据统计分析。数据采用单因素方差分析LSD 法，结果以Mean±SD表示。

2 结果与分析

2.1 临床症状和剖检变化

M组肉鸡精神沉郁，倦怠喜卧，羽毛蓬乱，表现呼吸困难，腹部膨胀，触之有波动感，内有大量黄色液体，右心肥厚伴有心包积液。肺脏和肾脏淤血肿大，小肠黏膜表面有淤血点，肝脏淤血肿大，边缘钝圆，质脆，触之有油腻感，颜色呈暗红色或棕黄色，有斑驳黄色条纹（见图1）。G、D组和L-Arg组以上症状均明显改善。

图1 肉鸡剖检观察Fig.1 Anatomical observation of broilers

2.2 复方中药水提液对肉鸡体重及AHI的影响

结果显示，15、25、35 日龄M 组肉鸡体重极显著低于K 组（P<0.01）。15、25、35 日龄G、D 组 和L-Arg 组 体 重 显 著 高 于M 组（P<0.01 或P<0.05）。35 日 龄G 组 体 重 显 著 高 于L-Arg 组（P<0.05）（见图2）。

?图2 复方中药水提液对AS肉鸡体重的影响Fig.2 Effects of compound Chinese medicine water extract on body weight of AS broilers

结果显示，35日龄M组肉鸡AHI极显著高于K组（P<0.01）。G、D 组和L-Arg 组肉鸡AHI 极显著低于M 组（P<0.01）。G、D 组肉鸡AHI 均极显著低于L-Arg 组（P<0.01）；G 组肉鸡AHI 极显著低于D组（P<0.01）（见图3）。

2.3 复方中药水提液对AS肉鸡肝纤维化的影响

Masson 染色结果表明，35 日龄K 组肉鸡肝小叶结构正常，肝索排列有规律，细胞间隙仅少量蓝染的胶原纤维；与K组相比，35日龄M组肉鸡肝细胞结构紊乱，肝小叶正常结构遭到破坏，可见明显胶原纤维沉积；与M 组相比，G、D 组和L-Arg 组肉鸡肝脏胶原纤维沉积程度改善明显（见图4）。

图4 复方中药水提液对AS肉鸡肝纤维化的影响（Masson染色，200×）Fig.4 Effects of compound Chinese medicine water extract on liver fibrosis in AS broilers(Masson-trichrome, 200×)

2.4 复方中药水提液对AS肉鸡肝脏MYPT1 mRNA相对表达量的影响

结果显示，35 日龄M 组肉鸡肝脏MYPT1 mRNA 相对表达量显著高于K 组（P<0.05）。G、D组肉鸡肝脏MYPT1 mRNA 相对表达量显著低于M组（P<0.01 或P<0.05），L-Arg 组与M 组无显著差异（P>0.05）。G、D组肉鸡肝脏MYPT1 mRNA 相对表达量与L-Arg 组均无显著差异，但呈下降趋势（P>0.05）（见图5）。

图5 复方中药水提液对AS肉鸡肝脏MYPT1 mRNA相对表达量的影响Fig.5 Effects of compound Chinese medicine water extract on relative expression of MYPT1 mRNA in liver of AS broilers

2.5 复方中药水提液对AS肉鸡肝脏RhoA、ROCK、MLCP、P-MLC蛋白含量的影响

结果表明，35日龄M组肉鸡肝脏RhoA、ROCK、P-MLC 蛋白极显著高于K组（P<0.01），MLCP蛋白活性极显著低于K 组（P<0.01）。G、D 组和L-Arg组肉鸡肝脏RhoA、ROCK、P-MLC 蛋白含量极显著低于M组（P<0.01），MLCP 蛋白活性极显著高于M组（P<0.01）。G、D组肉鸡肝脏RhoA、ROCK蛋白含量极显著低于L-Arg组（P<0.01），G组P-MLC蛋白含量显著低于L-Arg组（P<0.05），G、D组MLCP蛋白活性显著高于L-Arg组（P<0.01或P<0.05）；G组肉鸡肝脏RhoA蛋白含量极显著低于D组（P<0.01），MLCP蛋白活性显著高于D组（P<0.05）；D组ROCK蛋白含量极显著低于G组（P<0.01，见图6）。

图6 复方中药水提液对AS肉鸡肝脏RhoA、ROCK、MLCP、P-MLC蛋白含量的影响Fig.6 Effects of compound Chinese medicine water extract on the contents of RhoA,ROCK,MLCP and P-MLC protein in AS broiler livers

3 讨 论

本试验以多因素法复制模型[8]，模拟AS发病因素的多样性，结果显示，M组肉鸡表现出腹水、体重降低、AHI 升高，并可见肝脏大量胶原纤维沉积，发生纤维化，与前期研究结果一致[7]，本试验还观察到心肺组织形态异常等特征性变化，与杨慧萍等文献报道结果相同[10]，表明成功复制AS 模型。G、D 组和L-Arg 组肉鸡上述症状均有改善，表明复方中药水提液和L-Arg均可有效防治AS。

Aydın等研究表明，RhoA/ROCK通路调控肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）激活、增殖和收缩，是肝纤维化一个重要机制[11]。RhoA/ROCK通路激活后，通过磷酸化MYPT1 抑制MLCP 活性，MLC 不能去磷酸化，导致P-MLC 含量增多，肌动-肌球蛋白相互作用增加，增强肌动蛋白骨架聚合，致使HSCs 发生大量活化增殖，细胞外基质聚集，引发肝纤维化[11]。本试验中，AS 肉鸡肝脏RhoA、ROCK、P-MLC 及MYPT1 表达量均明显升高，MLCP 活性显著降低，表明RhoA/ROCK 通路被激活后，MYPT1 抑制MLCP 活性，从而抑制PMLC去磷酸化，导致大量HSCs 活化增殖发生肝纤维化，最终形成腹水。RhoA/ROCK 通路对心、肺等其他组织作用有待深入研究。

本课题组前期结果显示，缺氧诱导因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）、结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF）、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及TGF-β1/Smad 通路参与AS 肝纤维化的发生发展[7]。Wang、Mohamma⁃dalipour等研究表明，RhoA/ROCK通路作为HIF-1α上游通路，激活HIF-1α，并通过升高α-SMA、CTGF 表达，促进HSCs 活化，合成大量Ⅰ、Ⅲ型胶原，引发肝脏纤维化[12-13]。Feng 等研究表明，RhoA/ROCK 通路与TGF-β1/Smad 通路相互作用参与纤维化调控，ROCK 抑制剂Y-27632 通过影响Smad2 和Smad3 磷酸化，抑制TGF-β1 对其下游信号分子Smad2、Smad3 正反馈，下调α-SMA、CT⁃GF 基因和蛋白表达。TGF-β1/Smad 通路可通过上调RhoA、ROCK1 蛋白表达，致使MLC 磷酸化增加，肌动蛋白细胞骨架重组，影响HSCs 收缩、迁移、增殖、自噬和凋亡等生物学行为和功能[14]。因此，RhoA/ROCK通路直接参与AS发生发展，作用机制与其调控的多靶点密切相关。

中兽医学认为，AS 证候主要由气血两虚、气滞血瘀和水湿停聚所致，治疗宜补气补血、活血行气、利水渗湿[7]。本试验采用的自拟复方中药水提液由补中益气的黄芪、活血祛瘀的丹参、补血养血的当归、渗湿健脾的茯苓等中药配伍而成，前期研究表明可有效防治AS[15]。本试验检测结果，G、D组肉鸡肝脏RhoA、ROCK、MYPT1及PMLC 表达量均显著降低，MLCP 表达量显著升高，其中复方中药水提液高剂量组因子变化趋势最显著，表明复方中药水提液可通过调节RhoA/ROCK通路，抑制肝纤维化，有效防治AS，且G 组防治AS 的效果最显著。研究表明，黄芪甲苷可通过抑制HSCs 活化发挥抗肝纤维化作用[16]，由黄芪为君药的黄芪温心组方具有益气活血功效，可降低RhoA、ROCK表达，抑制心肌纤维化[17]；丹参活性成分可调控RhoA/ROCK 通路，导致p-MLC蛋白表达下降，阻断HSCs 增殖，Ⅰ型胶原合成、分泌等生物学活性，逆转肝纤维化进程[18-19]；当归红芪多糖通过干预氧化应激抑制RhoA/ROCK 通路活化[20]，具有活血利水功效的当归芍药散通过下调HSCs 中RhoA、ROCK2 蛋白表达，抑制内皮素诱导的HSCs 收缩[21]；活血化瘀的桂枝茯苓丸可降低RhoA、ROCK1、P-MLC 表达，抑制RhoA/ROCK通路激活，治疗子宫腺肌病[22]。本课题组前期试验表明，复方中药水提液可抑制HIF-1α、α-SMA、CTGF 及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达，调节TGF-β1/Smad通路，有效防治AS 肝纤维化[7]，结合本试验研究结果，复方中药水提液有效防治AS 的作用机制与RhoA/ROCK 通路及其调控的多靶点密切相关，与复方中药水提液配伍及其有效成分的药理作用相关。RhoA/ROCK 通路介导的下游P-MLC 可作为研究AS病理机制及其防治药物筛选的新靶点。

L-Arg是肉鸡必需氨基酸，促进肉鸡生长、降低AS 发生率[23]，在肉鸡体内可通过一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）转化成一氧化氮（Nitri⁃coxide，NO），扩张血管，降低肺动脉高压[23]。因此，L-Arg 常被用作防治AS 的药物[6]。肝脏是NO主要合成场所，HSCs 通过表达内皮型NOS（Endo⁃thelial nitric oxide synthase，eNOS）促进NO 合成，使血管产生舒张效应[21]。研究表明，NO 通过转换MYPT1 亚型，激活MLCP，发挥舒张血管的作用[24]。ROCK 是eNOS 和内皮NO 产生的负调控因子[25]，ROCK 抑制剂可减少红细胞ROCK 含量，上调eNOS 活性和促进NO 生成，延缓肺动脉高压进程[26]。韩烨晨等研究表明，L-Arg 能够调节肝脏TGF-β1/Smad通路，抑制HIF-1α、α-SMA、CTGF及Ⅰ、Ⅲ型胶原表达[7]，结合本试验结果，L-Arg可影响RhoA/ROCK 通路介导的下游MLC 磷酸化，抑制肝纤维化从而有效防治AS。

本研究发现，复方中药水提液和L-Arg均可有效防治AS，高剂量复方中药水提液效果最佳，与其能够通过RhoA/ROCK通路抑制AS肉鸡肝纤维化相关。