4种消除高粱直链淀粉测定中支链淀粉干扰的方法比较

卜庆状，邹雪梅，郝晓莉，詹德江

辽宁省农业科学院 农业质量标准与检测技术研究所（沈阳 100161）

淀粉是高粱的主要营养成分之一，占高粱籽粒可食用部分70%～80%[1-2]。高粱淀粉主要由直链淀粉和支链淀粉组成，其含量高低及比例对高粱口感、酿造品质和出酒率具有重要影响，同时也是高粱糯性的评价指标之一[3-6]。因此，准确测定高粱中淀粉含量对于高粱的食用、加工及品质评价具有重要意义。

目前，主流的测定方法仍然是基于碘离子与直、支链淀粉生成显色反应物的分光光度比色法[7]。该方法操作简便、仪器及试剂门槛较低，是标准中最常采用的方法[8]。基于此原理的测定方法被广泛应用在谷物直链淀粉含量测定上，但是支链淀粉能与碘结合形成紫色络合物，会对直链淀粉的测定造成干扰，引起测定误差[9]。因此研究如何消除干扰成为了高粱直链淀粉测定过程中亟需解决的问题之一。近年来，多采用混标单波长[10-11]或双波长法[12-13]多用来测定直链淀粉含量。三波长分光光度法最显著的特征就是消除非目标物的干扰，在食品方面多应用于测定黄酮[14-15]和齐墩果酸[16]等活性物质上。上述方法在消除支链淀粉干扰方面缺少数据支撑和横向比较。因此，文章选取了高粱源支链淀粉纯品作为干扰，根据分光光度计全扫描谱图，确立了4种直链淀粉测定方法，以期最大程度降低支链淀粉干扰，建立高粱直链淀粉测定方法。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

材料：7份直链淀粉含量不同的商品高粱，其中样品2和3为糯高粱。

试剂：直链淀粉纯品（马铃薯源，纯度97.10%）和支链淀粉纯品（高粱源，纯度78.67%）：农业农村部谷物及制品质检中心（哈尔滨）；碘、碘化钾、氢氧化钠、95%乙醇、冰乙酸、石油醚（沸程30～60℃）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器与设备

UV-2550紫外可见分光光度计[岛津企业管理（中国）有限公司]；HH-8数显恒温水浴锅（常州荣华仪器制造有限公司）；XS64万分之一电子天平[梅特勒托利多科技（中国）有限公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 标准溶液制备

分别称取0.103 0 g直链淀粉纯品和0.127 1 g支链淀粉纯品（按100%折算后结果）于150 mL三角瓶中，加入1 mL体积分数为95%乙醇润湿粉末，再加入9 mL 1 mol/L NaOH轻轻摇晃使粉末分散，沸水浴加热10min后迅速冷却，移入100 mL容量瓶中用水定容，得到1 mg/mL的直链淀粉和支链淀粉标准溶液。

1.3.2 样品制备

准确称取经0.050 g过索式提取法脱脂的0.25 mm高粱样品粉末于150 mL三角瓶中，加入0.5 mL体积分数为95%乙醇润湿粉末，再加入1 mL 1 mol/L NaOH轻轻摇晃使粉末分散，沸水浴加热10 min后迅速冷却，移入50 mL容量瓶中用水定容，准确吸取2.50 mL定容液于50 mL容量瓶中，加适量水，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘试剂，用水定容，摇匀，显色30 min后测定。

1.3.3 标准曲线绘制

直链淀粉标准液的配制：分别取0.1，0.3，0.5，0.7和1.0 mL直链淀粉标准工作液于50 mL容量瓶，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘试剂，用蒸馏水定容，按根据样品制备过程，工作曲线按百分制计算为4%，12%，20%，28%和40%。室温静置30min后摇匀，待用。

支链淀粉标准液的配制：分别取0.75，1.05，1.25，1.45和1.65 mL支链淀粉标准工作液于50 mL容量瓶，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘试剂，根据样品制备过程，工作曲线按百分制计算为30%，42%，50%，58%和66%。室温静置30 min后摇匀，待用。

混合标准液的配制：设定直链淀粉和支链淀粉含量总和为70%，按计算公式推算出直、支链淀粉标准工作液用量，混合于50 mL容量瓶中，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘试剂，用蒸馏水定容，根据样品制备过程，工作曲线按百分制计算（以直链淀粉含量计）为4%直+66%支，12%直+58%支，20%直+50%支，28%直+42%支以及30%直+40%支。室温静置30 min后摇匀，待用。

1.3.4 测定方法确定

混标单波长法：以特定的直链淀粉标准样品波长为测定波长，按混合标准液绘制标准曲线，以吸光度为纵坐标，混合淀粉中直链淀粉含量为横坐标。

混标双波长法：以直链淀粉标准样品最大吸收波长为测定波长，通过作图，在支链淀粉上找到参比波长，按混合标准液绘制标准曲线，以混合标准样品测定波长和参比波长的差值为横坐标，混合淀粉中直链淀粉含量为横坐标。

混标三波长法：依据三波长原理，按混合标准液绘制标准曲线，在确定的3个波长λ1、λ2、λ3下测定吸光度A1、A2、A3，按公式ΔA=A2-[（λ2-λ1）×A1+（λ3-λ2）×A3]/（λ3-λ1）计算ΔA，以ΔA为纵坐标，混合淀粉中直链淀粉含量为横坐标。

1.3.5 验证试验

为了考察和比较各方法对支链淀粉与碘显色反应干扰消除情况，配制10%和20%直链淀粉标准溶液并混入不同含量的高粱支链淀粉标液，按表1配制成验证液，加入0.5 mL 1 mol/L CH3COOH溶液和1 mL碘试剂，用水定容至50 mL，待用。

表1 验证试验设计表 单位：%

1.4 数据处理

利用Excel 2020和Origin 8.0作图，SPSS 22.0对数据进行处理。

2 结果与分析

2.1 直、支链淀粉标准样品全扫描图

利用直、支链淀粉与碘显色反应原理，采用分光光度计全扫描方式，得到直、支链淀粉及混合标样400～800 nm光谱全扫描图。如图1所示，直链淀粉在400～800 nm的最大吸收波长位于650 nm处，随着浓度的不断升高，650 nm处吸光度呈现上升趋势，因此可选择直链淀粉全扫描光谱的最大吸收波长作为测定波长。如图2所示，支链淀粉在400～800 nm处最大吸收波长为548 nm。如图3所示，将直链淀粉和支链淀粉按照加和为70%的方式混合后发现，混合标样的最大吸收波长发生了偏折，随着直链淀粉占比不断加大，最大吸光度不断接近650 nm，由于支链淀粉的加入，在相同直链淀粉含量下，混合标样最大吸收波长处吸光度要明显高于直链淀粉标样，支链淀粉占比越高，两者差距越明显，可见支链淀粉的干扰不仅在量上明显，而且还体现在对最大吸收波长的改变上。

图1 不同含量直链淀粉标准样品全扫描图

图2 不同含量支链淀粉标准样品全扫描图

图3 不同含量混合标准样品全扫描图

2.2 单波长比色法

直链淀粉测定时，一般选择最大吸收波长作为测定波长，因此结合图1，选择650 nm处作为测定波长。如图4所示，在测定过程中发现，700～800 nm相同浓度的直链淀粉标样和混合标样基本重合，说明在这一波段支链淀粉的影响较少。观察不同浓度支链淀粉全扫描图谱发现，不同浓度支链淀粉在740～800 nm处吸光度较低。因此，可选择740 nm处作为测定波长，此波长处支链淀粉的碘显色反应影响较弱且吸光度较大。混标单波长法在650 nm处标准曲线为y=0.015 1x+0.053 3，r=0.999 9；在740 nm处标准曲线为y=0.011 4x-0.004，r=0.999 8。

图4 直、支及混合标准样品全扫描叠加图

2.3 双波长比色法

配制12%直链淀粉标准溶液和58%支链淀粉标准溶液，分别在400～800 nm进行全扫描，得到直、支链淀粉标准样品全扫描叠加图。由图5可知，直链淀粉最大吸收波长为650 nm，根据双波长法作图原理，在支链淀粉上找到参比波长为432 nm。混标双波长法标准曲线方程为y=0.013 1x-0.020 8，r=0.999 9。

图5 双波长法测定波长确定

图6 三波长法波长确定

2.4 三波长法比色法

三波长法能有效消除杂质对紫外吸收波长的影响，根据三波长法制图原理，对直链淀粉含量为20%的直链淀粉标准样品进行全扫描，得到所需三个波长，分别为λ1=531 nm、λ2=650 nm、λ3=800 nm，根据公式求得ΔA。混标三波长法标准曲线方程为y=0.017 8x-0.075 3，r=0.996 4。

2.5 验证试验

向10%和20%直链淀粉中加入不同含量的支链淀粉，用以验证测定方法对支链淀粉影响的消除作用。通过图7可见，方法1采用混标单波长法在650 nm处测定，随着支链淀粉含量增加直链淀粉呈现明显上升趋势，加标回收率为91.19%～108.18%，平均回收率为99.89%，SRSD为5.98%。虽然混标可以使测定值更接近真实值，但是所测定值随着支链淀粉含量增加直链淀粉呈现上升趋势，可见支链淀粉对测定影响较大。方法2在740 nm处测定，结果发现所得数据结果与支链淀粉淀粉含量无关，加标回收率为98.25%～104.39%，平均回收率为101.04%，SRSD为3.16%。方法3采用混标双波长法，加标回收率为98.78%～112.06%，平均回收率为104.80%，SRSD为4.74%。双波长法所得结果与支链淀粉含量无关，测定值略高于真值。方法4为混标三波长法，该方法测定结果与添加值相差较大，不适合直链淀粉的测定。综上所述，方法2和方法3较适合测定高粱中直链淀粉含量，可有效消除支链淀粉对碘显色反应的影响。

图7 不同测定方法比较

2.6 样品检测验证

采用方法2和方法3测定7个高粱样品，其中Y2和Y3为糯高粱，其余样品为粳高粱。由表2可知，除Y2和Y3，方法2和方法3差异不显著。在设定直链淀粉和支链淀粉含量加和为70%的体系中，由于随着支链淀粉含量的增加，混标的最大吸收波长出现了左移的现象，糯性高粱直链淀粉含量很低，支链淀粉含量较高，造成双波长法出现650 nm处测定值接近或小于432 nm处参比波长情况，两者差值过小，造成测定误差加大。

表2 高粱样品测定结果

3 结论

通过对650 nm处混标单波长（方法一）、740 nm处混标单波长（方法二）、混标双波长（方法三）和混标三波长（方法三）验证试验和加标回收率结果分析，方法二和方法三可准确测定高粱直链淀粉含量，并且能够有效地消除测试过程中支链淀粉的干扰。通过测定实际高粱样品发现，方法二计算简单，适合高粱直链淀粉含量测定，在设定直链淀粉和支链淀粉含量加和为70%的体系中，方法三不适合测定低直链淀粉的糯性高粱样品，方法三可开发直链淀粉和支链淀粉同时测定方法，但要注意混合标中直链淀粉和支链淀粉的比例。